第三章 結果
3.4 不同等電點異構物之紅血球凝集素 1 (HA1) 可能是由其醣質之唾液酸修飾
3.4.4 以凝集素染色法分析經唾液酸酶水解後之 HA1
由於結果 3.4.1 中，發現神經胺酸水解酶會影響 HA1 之 6 個異構物，且結果 3.4.2 中，以凝集素染色法發現 HA1 可能有唾液酸化，但於結果 3.4.3 中，唾液酸酶處理 HA1 後以 HPAEC 無法偵測到唾液酸，因此開始懷疑 HA1 上是否真的存在唾液酸。
本實驗將唾液酸酶處理過之病毒，以凝集素染色法分析，發現隨著唾液酸酶處理時間愈 長，HA1 之蛋白質量漸少，並從酶切 24 hr 後開始，在 36 kD 形成新的蛋白質條帶，
經由質譜定序分析後發現此蛋白質亦為 HA1，且此條帶也可結合 MAA，圖 3.12。因 此推論，HA1 可能在酶切過程中降解，因此 HA1 蛋白質量會減少；而經由唾液酸酶 酶切過後，無論是 50 kD 或 35 kD 之 HA1 皆可結合 MAA，則表示唾液酸酶並無作 用，亦或是 HA1 本身並無唾液酸修飾，也就是說 MAA 與 HA1 醣質為非專一性結 合。為了解 HA1 確切之醣質結構，實驗接著進行建構 HA1 之醣質表現圖譜。
a b
no sialidase sialidase 1 hr
sialidase 4 hr sialidase 24 hr
e
sialidase 48 hr f
pH 3 pH 10
sialidase 48 hr western blot
Figure 3.8 Neuraminidase treatment of the virulent (2838V) avian influenza viruses
a b c
Figure 3.9 Sialyoglicoproteins were detected by MAA and SNA. Asialofetuin and fetuin were used as negative (-) and positive (+) controls, respectively
a b
Figure 3.10 Sialyoglycoproteins were analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and MAA/SNA lectins
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 -20
50 100 160nC
min 1.8
2.4
3.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0
-20 50 100 150 220nC
min 1.8
2.4
3.0 5.0
NeuNAc
NeuGAc KDN
2838N HA1
2838V HA1 a
b
c
圖 3.11 以高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 配合脈衝式安培法偵測器 (PAD) 分析 血液凝集素 1 (HA1) 表面醣化中之唾液酸亞型
Figure 3.11 Sialic acid composition in HA 1 was analyzed by high performance anion-exchange chromatography (HPAEC), coupled with pulsed amperometric detection (PAD)
a b c Figure 3.12 Lectin blotting analysis of HA1 after sialidase treatment
3.5 血液凝集素 1 (HA1) 之醣質表現圖譜
HA1 有 4 至 6 個可能之 N-醣基化位置 (N-glycosylation sites) (圖 3.4 b)，本實驗 以 凝 集 素 染 色 為 基 礎 之 QIAGEN 醣 晶 片 分 析 HA1 之 醣 質 ， 接 著 使 用 MALDI-TOF/TOF 質譜儀，研究 HA1 之醣質表現圖譜。
3.5.1 使用醣晶片分析 HA1 之醣質
本實驗利用 Qproteome GlycoArray Kit 分析 HA1 之醣質，此醣晶片各點固定 了特定之凝集素，若 HA1 之醣質可和固定之凝集素結合，配合 HA 之單株抗體以 及帶有螢光之二次抗體，即可得知 HA1 醣質之概況。結果如圖 3.13 所示，首先 HA1 之醣質可能有 N-複雜型 (N-complex type) 之結構，如二分支 (biantennary) 和 三、四分支 (tri-/tetraantennary) 等複雜結構。次之 HA1 可能有 N-醣基之核心甘露 醣 (mannose) 或是 high-mannose 型之醣結構。接著 HA1 醣鏈之尾端可能是半乳糖 (galactose) 或 N-乙醯半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine)。另外，HA1 有 β 半乳糖 (β-galactose) 訊號顯示，表示 HA1 有部分之醣鏈之末端為半乳糖，且無接上唾液 酸。而醣晶片也發現 HA1 之醣質有岩藻醣基化 (fucosylation) 之現象。最後，HA1 有被偵測到大量的唾液酸訊號 (sialic acid)，表示 HA1 除了有部分半乳糖或 N-乙醯 半乳糖胺作為醣鏈末端的醣質之外，亦有許多以唾液酸為末端之醣質。而此醣晶片 若是唾液酸之訊號過強，則會導致 β 半乳糖、N-乙醯半乳糖胺及 N-乙醯葡萄糖胺之 訊號較為低落 (Qproteome glycoarray handbook)，此現象亦可在圖 3.13 發現。偵測 到大量之唾液酸訊號，表示 HA1 有一種以上之醣基末端為唾液酸，而此以凝集素 染色為基礎之醣晶片，快速的提供了 HA1 醣質之概況，可輔助 3.5.3 質譜儀之醣 質體分析。
3.5.2 使用 HPLC 配合螢光偵測器分析 HA1 之醣質
HA1 只 有 N-glycans 而 無 O-glycans ， 本 實 驗 將 HA1 之 N-glycans 以 PNGase F 於電泳膠體內酶切釋放，接著以 2-aminobenzamide 進行螢光標定，並使 用 HPLC 分析 HA1 之醣質，流程如圖 3.14 a 所示。結果顯示 HA1 有 10 種左 右不同大小之 N-glycans，圖 3.14 b。
3.5.3 以 MALDI-TOF/TOF MS 及 MS/MS 研究 HA1 之醣質表現圖譜
本實驗利用質譜儀進行 HA1 醣質定序與醣質體之質譜分析，實驗流程如圖 3.15 所示。首先以二次元電泳分離 6 種 HA1 之異構物，接著切下 HA1 各蛋白質點進 行膠內水解後，使用 PNGase F 釋放 N-glycans，並以 Sep-Pak C18 小柱分離胜肽鏈 及醣質，接著將分離的醣質泛甲基化後，以 MALDI TOF/TOF MS 及 MS/MS 進行 醣質定序。圖 3.13 為 MALDI TOF/TOF MS 比較病毒株最鹼性之 HA1 異構物之醣 質差異。結果顯示，兩株病毒株並無明顯差異圖 3.16。毒性病毒株最鹼性之 HA1 異 構物經由 MALDI MS 分析後 (圖 3.17 a)，選出三組 m/z 值分別為 1579.8、1867.0
和 2489.2 作為前驅者 (precursor)，進行 MS/MS 之醣質定序，可得到圖 3.17 呈現 之醣質結構。
首先，m/z 1579.8 之醣質為 5 個 mannose 之 high mannose type 醣鏈 (圖 3.17 a)；而 m/z 1867 之醣質為 m/z 1579.8 之醣質再加上一個 m/z 287.2 之物質，將此 未知物質稱為 X，此醣質稱為 X-glycan (圖 3.17 b)；而 m/z 2489.2 之醣質為 N-複 雜型 (N-complex type) 之三分支 (tri-antennary) 結構 (圖 3.17 c)。
而使用上述三個醣質之確切結構，則可由 MALDI MS 之結果 (圖 3.16) 推測出 其餘醣質之結構。表 3.2 為 HA1 十個主要醣質之組成及結構分析，可發現 m/z 2070.3 及 m/z 2244.4 為 N-複雜型之二分支 (bi-antennary) 醣質，其中 m/z 2244.4 較 m/z 2070.3 多一個 fucose；m/z 2489.2、m/z 2693.6 及 m/z 2867.8 為 N-複雜型 之三分支 (tri-antennary) 醣質，其中 m/z 2489.2 為確切解出之結構，m/z 2693.6 較 m/z 2489.2 多一個 fucose，m/z 2693.6 較 m/z 2867.8 多出兩個 fucose；m/z 2968.8、
m/z 3143.0 及 m/z 3317.2 為 N-複雜型之四分支 (tetra-antennary) 醣質，m/z 3143.0 較 m/z 2968.8 多一個 fucose，m/z 3317.2 較 m/z 2968.8 多兩個 fucose。
另外，使用 MALDI TOF/TOF MS 比較各 HA1 異構物之醣質差異，可發現等電 點越低，也就是越酸之 HA1 異構物，其 m/z 1867 之 X-glycan 含量比例越高，如 圖 3.18 所示。表 3.3 為 HA1 異構物各醣質之含量比較。
圖 3.13 利用 Qproteome 醣晶片分析血液凝集素 1 (HA1) 之醣質
Figure 3.13 Qproteome GlycoArray Kit analysis for the glycan of hemagglutinin 1 (HA1)
a
b
Virus purification
Protein separation (SDS-PAGE)
Glycans were released with PNGase F within gel Extraction of N-glycans
2-aminobenzamide (2AB) labeling
Separation of N-glycan by HPLC with fluorescence detection
mV
Column: TSKgel amide-80 Detection: fluorescence detector Flow rate: 1 mL/min
Eluent: A. 20% 50 mM NaOAc/ACN B. 50 mM NaOAc
Figure 3.14 HPLC analysis of fluorescence-labeled HA1 N-glycans of virulent strain
Virus purification Protein separation (2-DE)
Trypsin in-gel digestion of glycoproteins Extraction of peptides
Removing N-glycans from glycopeptides with PNGaseF Separation of peptides and oligosaccharides by Sep-Pak C18 column
MALDI-TOF MS/MS protein ID permethylation of glycans
N-Glycan profiling by MALDI- TOF/TOF MS/MS peptides oligosaccharides
Virus purification Protein separation (2-DE)
Trypsin in-gel digestion of glycoproteins Extraction of peptides
Removing N-glycans from glycopeptides with PNGaseF Separation of peptides and oligosaccharides by Sep-Pak C18 column
MALDI-TOF MS/MS protein ID permethylation of glycans
N-Glycan profiling by MALDI- TOF/TOF MS/MS peptides oligosaccharides
圖 3.15 醣質定序與醣質體之質譜分析流程 Figure 3.15 Workflow of N-glycans profiling
2838N HA1
pH low high pH low high
2838V HA1
pH low high pH low high
圖 3.16 MALDI MS 比較毒性與非毒性禽流感病毒株 HA1 之醣質表現圖譜.
Figure 3.16 Comparison by the MALDI TOF/TOF MS glycan profiles for hemagglutinin 1 between 2838N and 2838V
B1,5XMan
a m/z 1579.79
b m/z 1866.99
X
X: m/z 287.20
1792.67 1677.20 1268.81 860.54 615.39
m/z
0,4XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XGalNAc type structure
1792.67 1677.20 1268.81 860.54 615.39
m/z
0,4XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XGalNAc type structure
X X
X
X X
c m/z 2489.20
Figure 3.17 MALDI MS/MS analysis of HA1 N-glycans of virulent strain a. 以 m/z 1579 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS
b. 以 m/z 1867 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS c. 以 m/z 2489 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS
Hex7HexNAc6Fuc2 Table 3.2 The N-glycans of HA1
a
Intens: 1.25 : 1
Intens: 3.08 : 1 :
X-glycan
Intens: 1.76 : 1
Intens: 2.53 : 1
Intens: 3.18 : 1
pH low high pH low high
pH low high pH low high
pH low high pH low high
pH low high pH low high pH low high pH low high
pH low high pH low high pH low high pH low high pH low high pH low high X-glycan :
b
圖 3.18 比較 HA1 異構物之間 X-醣鏈之差異
Figure 3.18 Comparison for the X-glycans between HA1 isoforms
2838V
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
m/z
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
m/z
表 3.3 比較非毒性與毒性禽流感病毒株之 HA1 異構物之間醣質比例之差異 Table 3.3 Comparison for the N-glycans ratio of HA1 between 2838N and 2838V
第四章 討論
4.1 探討非毒性及毒性病毒株之間 HA1 等電點之差異，及其各自形成 6 種等電點異構 物之生理意義
HA 被專一性的蛋白水解酶切割成 HA1 及 HA2 後，始具有感染能力，而這些專 一性的蛋白水解酶也進一步造成了病毒感染的組織趨性 (tissue tropism)；另外，研究也 發現 HA1 蛋白質本身酸鹼性的改變，會影響流感病毒與受體結合的特性，進而造成組 織趨性 65。本實驗使用之兩株病毒株中，非毒性病毒株並無特定的組織趨性，且感染後 並無明顯症狀；但毒性病毒株則會特定攻擊腎臟，造成宿主腎臟缺失並死亡，這樣特定 的組織趨性，可能和毒性株的 HA1 較呈鹼性相關。比較兩株病毒株 HA1 在 329 個胺 基酸中只有 2 個不同，但此 2 個胺基酸差異卻使非毒性與毒性株之 HA1 相差 3 個 電荷 (由 2 個酸性胺基酸變成 1 個中性及 1 個鹼性胺基酸)，這樣的差異使毒性株之 HA1 較鹼性，可能會影響病毒與受體結合的特性，進而造成組織趨性，使毒性病毒株 趨向於感染腎臟組織。
本實驗使用的兩株病毒株，都各有 6 個等電點異構物，而在先前的研究亦發現大 部分流感病毒之 HA1 皆會形成多個異構物 63,66，而此現象亦被稱為 HA1 之 charge heterogeneity。然而，對於這些多型性 HA1 之研究並不完整，無論是如何形成這些異 構物以及這些異構物的功能都尚未被研究清楚。雖然尚未有研究提到為何 HA1 會有多 種等電點異構物，但可以從既有的知識及演化的概念推知，HA1 之多型性可能和病毒 的生存有關，因 HA 之酸鹼性會影響其感染之組織趨性 65，因此若 HA1 本身就擁有 等電點差異甚大的多種異構物，則有幫助病毒在宿主體內感染及擴散。此外，流感病毒 之 HA 蛋白質為宿主辨識最主要的抗原，而宿主產生之抗體也會和 HA 結合並進行中 和反應，而 HA1 多種異構物可能也有助於病毒逃脫宿主之免疫系統，只要有一種以上 之異構物沒有被免疫系統攻擊，病毒存活的機率就會增加，因此認為 HA1 形成多種等 電點異構物，可能和流感病毒之生存及感染能力有關係。
4.2 HA1 之醣基化位置與其功能探討
流感病毒之 HA 皆有不同程度之 N-醣基化，經由預測發現，本實驗所使用的兩株 病毒株醣基化位置並無差異，且分別有 4 至 6 個可能的醣基化位置。在 1.2.4 提到目 前已知 HA 之醣基化與其功能的關係，著重在醣基化位置是否影響蛋白質三級結構功 能區塊。因此，我們以 Discovery Studio 2.0 軟體，利用目前已知結構之 1HA0 (PDB ID) 為模板，進行蛋白質三級結構之模擬，並標示出可能醣基化之 ASN-X-Ser/Thr 位於蛋 白質三級結構之位置，如圖 4.1 所示。結果顯示，Asn-167 位於球狀頭部頂端，且在受
體結合區的對面，此醣基化位置可能不會減少宿主之結合力，但可能遮蔽 HA 頂端之 抗原結合位置，幫助 HA 逃脫宿主免疫系統。而位於 HA1 中段亦有兩個可能之醣基 化位置，Asn-291 和 Asn-296，這兩個醣基化位置距離受體結合區與蛋白質水解切位較 遠，但亦可能會影響蛋白質之折疊 (folding)。此外，Asn-23、Asn-10 及 Asn-11 和蛋 白質水解切位較接近，因此本實驗之兩株病毒株切位可能會被醣質所遮蔽。然而，蛋白 質水解切位是決定病毒致病力強弱的重要依據，此兩株病毒株都編列於低病原性禽流感 病毒，可能是因為醣基化位置遮蔽蛋白質水解切位所造成 67。
4.3 除了醣基化外，蛋白質骨架本身及其它蛋白質轉譯後修飾亦可能造成 HA1 異構物
異構物形成之原因亦可能是由蛋白質骨架本身及其他轉譯後修飾所共同造成。有研
異構物形成之原因亦可能是由蛋白質骨架本身及其他轉譯後修飾所共同造成。有研