4.1 探討非毒性及毒性病毒株之間 HA1 等電點之差異，及其各自形成 6 種等電點異構 物之生理意義
HA 被專一性的蛋白水解酶切割成 HA1 及 HA2 後，始具有感染能力，而這些專 一性的蛋白水解酶也進一步造成了病毒感染的組織趨性 (tissue tropism)；另外，研究也 發現 HA1 蛋白質本身酸鹼性的改變，會影響流感病毒與受體結合的特性，進而造成組 織趨性 65。本實驗使用之兩株病毒株中，非毒性病毒株並無特定的組織趨性，且感染後 並無明顯症狀；但毒性病毒株則會特定攻擊腎臟，造成宿主腎臟缺失並死亡，這樣特定 的組織趨性，可能和毒性株的 HA1 較呈鹼性相關。比較兩株病毒株 HA1 在 329 個胺 基酸中只有 2 個不同，但此 2 個胺基酸差異卻使非毒性與毒性株之 HA1 相差 3 個 電荷 (由 2 個酸性胺基酸變成 1 個中性及 1 個鹼性胺基酸)，這樣的差異使毒性株之 HA1 較鹼性，可能會影響病毒與受體結合的特性，進而造成組織趨性，使毒性病毒株 趨向於感染腎臟組織。
本實驗使用的兩株病毒株，都各有 6 個等電點異構物，而在先前的研究亦發現大 部分流感病毒之 HA1 皆會形成多個異構物 63,66，而此現象亦被稱為 HA1 之 charge heterogeneity。然而，對於這些多型性 HA1 之研究並不完整，無論是如何形成這些異 構物以及這些異構物的功能都尚未被研究清楚。雖然尚未有研究提到為何 HA1 會有多 種等電點異構物，但可以從既有的知識及演化的概念推知，HA1 之多型性可能和病毒 的生存有關，因 HA 之酸鹼性會影響其感染之組織趨性 65，因此若 HA1 本身就擁有 等電點差異甚大的多種異構物，則有幫助病毒在宿主體內感染及擴散。此外，流感病毒 之 HA 蛋白質為宿主辨識最主要的抗原，而宿主產生之抗體也會和 HA 結合並進行中 和反應，而 HA1 多種異構物可能也有助於病毒逃脫宿主之免疫系統，只要有一種以上 之異構物沒有被免疫系統攻擊，病毒存活的機率就會增加，因此認為 HA1 形成多種等 電點異構物，可能和流感病毒之生存及感染能力有關係。
4.2 HA1 之醣基化位置與其功能探討
流感病毒之 HA 皆有不同程度之 N-醣基化，經由預測發現，本實驗所使用的兩株 病毒株醣基化位置並無差異，且分別有 4 至 6 個可能的醣基化位置。在 1.2.4 提到目 前已知 HA 之醣基化與其功能的關係，著重在醣基化位置是否影響蛋白質三級結構功 能區塊。因此，我們以 Discovery Studio 2.0 軟體，利用目前已知結構之 1HA0 (PDB ID) 為模板，進行蛋白質三級結構之模擬，並標示出可能醣基化之 ASN-X-Ser/Thr 位於蛋 白質三級結構之位置，如圖 4.1 所示。結果顯示，Asn-167 位於球狀頭部頂端，且在受
體結合區的對面，此醣基化位置可能不會減少宿主之結合力，但可能遮蔽 HA 頂端之 抗原結合位置，幫助 HA 逃脫宿主免疫系統。而位於 HA1 中段亦有兩個可能之醣基 化位置，Asn-291 和 Asn-296，這兩個醣基化位置距離受體結合區與蛋白質水解切位較 遠，但亦可能會影響蛋白質之折疊 (folding)。此外，Asn-23、Asn-10 及 Asn-11 和蛋 白質水解切位較接近，因此本實驗之兩株病毒株切位可能會被醣質所遮蔽。然而，蛋白 質水解切位是決定病毒致病力強弱的重要依據，此兩株病毒株都編列於低病原性禽流感 病毒，可能是因為醣基化位置遮蔽蛋白質水解切位所造成 67。
4.3 除了醣基化外，蛋白質骨架本身及其它蛋白質轉譯後修飾亦可能造成 HA1 異構物
異構物形成之原因亦可能是由蛋白質骨架本身及其他轉譯後修飾所共同造成。有研 究指出抑制 HA1 之醣基化後，HA1 依舊可生成多個異構物 66。而蛋白質轉譯後修飾，
除 了 醣 基 化 (glycosylation) 以 外 ， 可 能 使 蛋 白 質 骨 架 酸 化 的 還 包 括 ： 磷 酸 化 (phosphorylation)、硫酸鹽化 (sulfation)。目前研究發現，HA 預測出許多磷酸化位置 68， 使用軟體預測本實驗所使用的兩株病毒之 HA1 序列，亦有許多磷酸化位置，然而經由 本實驗發現 HA1 並無磷酸化現象。另外，有文獻指出 HA 之醣基有被硫酸鹽化 69； 亦有文獻預測 HA 之 Tyr 可能會被硫酸鹽化 70。由以上種種研究可發現，形成 HA1 多種異構物之原因可能不只單單因為醣基化所造成，可能還和蛋白質骨架本身及其餘轉 譯後修飾有關。
4.4 m/z 1867 之 X-glycan 尚未被報導過
HA1 有多種等電點異構物，於 30 年前進行二次元電泳就已被發現 63，但當時作 者引用前人 HA 全醣分析之研究，認為 HA1 上並無唾液酸 71，故這些異構物形成之 原因並非由唾液酸所造成。本研究利用 lectin blot 發現，於雞胚蛋內繁殖之病毒的 HA1 可能有 α-2,3 之唾液酸化修飾，且等點點越低之 HA1 異構物被 MAA 結合的能力越 強，但無論是以唾液酸水解酶或是 HPAEC-PAD 分析都無法獲得預期之結果，因此進 行 MS/MS 分析，欲解出 HA1 之全醣結構。
以 MALDI MS/MS 的結果發現，HA1 之 10 種左右之醣質皆無唾液酸修飾。此結 過和前人之實驗相符 72，因此在凝集素染色中 MAA 與 HA1 醣質之結合可能是因為 一些非專一性結合所致。而有趣的是，實驗發現 HA1 最多之醣質為 m/z 1867 此未知 之醣質，稱之為 X-glycan，X-glycan 是由 m/z 1579 之 high mannose type 之醣質再接 上一個 m/z 287 之未知物質 X。
4.5 X-glycan 與 HA1 等電點異構物可能之兩種關係
比較各 HA1 異構物之間醣質之差異，可發現等電點越低，也就是越酸之 HA1 異 構物，其 X-glycan 含量比例越高。因此推論有兩種可能性，其一︰若 X 為酸性物質，
只有四個，若單單只是由 X-glycan 所造成，可能不會形成 6 種以上的等電點異構物，
因此亦有可能有其餘未知之轉譯後修飾參與。其二︰若 X 是中性物質，則代表不同等 電點異構物並非由醣基化所造成，而越酸性的 HA1 異構物接上 m/z 1579 及 m/z 1867 之 high mannose type 醣質之比例越高之成因，則是因為不同等電點之 HA1 會有不同 比例之醣基化。
圖 4.1 使用 Discovery Studio 2.0 軟體，進行兩病毒株 HA 之蛋白質三級結構模擬 Figure 4.1 Homology modeling of HA for two AIV strains by Discovery Studio 2.0