實驗設計

3.2.2 實驗設計

由於 3.2.1 預測之結果，發現 HA1 可能有 phosphorylation 及 glycosylation，

而醣基化若接上酸性醣，如廣泛存在之唾液酸，則有可能影響蛋白質之等電點，

因此實驗設計配合酶切、二次元電泳、免疫染色及凝血素染色及質譜儀分析，探究 HA1 形成 6 種異構物，是否為蛋白質磷酸化，或是醣基化所造成，圖 3.5。

a

b Non-virulent

virulent

Non-virulent

virulent

c Non-virulent virulent

圖 3.4 以軟體預測可能使 HA1 等電點變小之轉譯後修飾 Figure 3.4 Post-translational modification prediction of HA1

A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)

Purified virus

Dephosphorylation

Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP)1 U/30 µg

protein, 37℃ for 48 hr

Desialylation

Neuraminidase (sialidase) 0.04 U / 30 µg protein, 37℃ for

1-72 hr

Total protein precipitation with 10% TCA/Aceton

Two-dimensional electrophoresis (2-DE)

Phosphoproteome Western Blot

Anti-phospho-Ser/Thr/Tyr

In-gel digestion of excised protein spots for ESI-QUAD-TOF mass spectrometric characterization

Sialoglycoproteins Lectin Blot

MAA (α2-3); SNA (α2-6)

圖 3.5 以可能影響血液凝集素 1 (HA1)等電點之轉譯後修飾作用進行實驗設計

Figure 3.5 Experimental design based on the hemagglutinin 1 post-translational modifications that influence pI values

3.3 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 並非蛋白質磷酸化所造成

本段實驗接續 3.2 之實驗設計，研究 HA1 異構物形成的原因是否為蛋白質磷酸化 所致。實驗分別以鹼性磷酸酶處理禽流感病毒，以及使用抗磷酸化抗體進行免疫染色。

3.3.1 以鹼性磷酸酶處理禽流感病毒株並進行二次元電泳

本實驗使用鹼性磷酸酶處理病毒蛋白質，結果如圖 3.6 所示。在鹼性磷酸酶酶 切 48 小時後，HA1 蛋白質群點並無明顯變化，而 M1 分子量有明顯下降，比較控 制組及酶切組，可清楚分別磷酸化及去磷酸化之 M1。

3.3.2 以抗磷酸抗體進行二次元電泳之免疫染色

本實驗首先進行禽流感病毒之二次元電泳，接著轉印至 PVDF 膜並使用抗磷酸 抗體進行免疫染色，偵測磷酸化蛋白質。實驗結果如圖 3.7 所示，可發現 HA1 蛋 白質群點之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr) 並無磷酸化，另使用 anti-phosph-Tyr 單株 抗體偵測，發現在 ECL 呈色後，並無任何訊號，因此 HA1 之酪胺酸 (Tyr) 可能無 磷酸化，亦或是此株抗體失效。另外，實驗發現和 3.3.1 鹼性磷酸酶酶切結果相符，

間質蛋白 1 (M1) 之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr)有磷酸化現象。而 NP 之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr) 亦有明顯磷酸化。此外，二次元圖譜上約 100 kD 之 RNA 聚 合酶 A (RNA polymerase A，簡稱 PA) 之酥胺酸 (Thr) 有磷酸化，而藉由此實驗，本 實驗室第一次確定 PA 在二次元圖譜上的位置。配合 3.3.1 及本段結果得知，不同 等電點異構物之 HA1 並非由蛋白質磷酸化所造成。

a b

A: phosphorylated M1 B: dephosphorylated M1

圖 3.6 以鹼性磷酸酶處理非毒性與毒性禽流感病毒株並進行二次元電泳 Figure 3.6 Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP) treatment of total proteins of

the virulent and non-virulent avian influenza viruses

a b c

d e f

Anti-phospho-Ser Anti-phospho-Thr Anti-phospho-Tyr

M1

Figure 3.7 Immunoblot analysis of virus protein with anti-phospho-Ser, anti-phospho-Thr ,and anti-phospho-Tyr antibodies

3.4 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 可能是由其醣質之唾液酸修飾所造成

本段實驗接續 3.2 之實驗設計，研究 HA1 異構物形成的原因是否為醣蛋白質表面 醣基化之唾液酸修飾。實驗首先以神經胺酸水解酶 (neuraminidase, NA) 處理病毒全蛋 白質，發現 HA1 蛋白質點受酶切影響，接著使用凝集素染色法 (lectin blot)，發現 HA1 之醣質可能有 α-2,3 鍵結之唾液酸，最後企圖使用高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 分析唾液酸之亞型。

3.4.1 以神經胺酸水解酶處理禽流感病毒株並進行二次元電泳

以神經胺酸水解酶處理病毒全蛋白質 1 至 48 小時後，進行二次元電泳，銀染 後可發現，隨著處理時間的增長，HA1 蛋白質群點由等電點高至低，依序消失，如 圖 3.8 a-e 所示。酶切 1 小時後，HA1 蛋白質群點並無變化；4 小時後最鹼性之蛋 白質點消失；24 小時後，等電點最高的兩個點消失；48 小時後，等電點較高之 5 個 異構物消失。在酶切 48 小時後，使用質譜儀進行蛋白質身份鑑定，發現新產生之 24 kD 蛋白質為間質蛋白 1 (M1)，圖 3.8 f。而經酶切 48 小時後，進行二維電泳並 轉印至 PVDF 膜上，以 HA 單株抗體進行免疫染色，可發現等電點較高之 HA1 無 法被偵測，而酶切後之 HA1 亦無法由免疫染色偵測。雖然本實驗和預期結果不符，

但由 HA1 蛋白質群點由等電點高至低，依序消失的現象可得知，神經胺酸水解酶會 影響 HA1 之 6 個異構物。

3.4.2 以凝集素染色法 (lectin blot) 發現 HA1 之醣質可能有 α-2,3 鍵結的唾液酸 得知神經胺酸水解酶會影響 HA1 蛋白質群點後，繼續使用凝集素染色法 (lectin blot)，欲直接證明唾液酸的存在。使用的凝集素有兩種，第一種為 Maackia amurensis agglutinin (MAA)，可偵測唾液酸 α-2,3-半乳糖鍵結；第二種凝集素為 Sambucus nigra agglutinin (SNA)，可偵測唾液酸 α-2,6-半乳糖鍵結。實驗首先進行 SDS-PAGE 並轉染至 PVDF 膜上，接著使用 MAA 及 SNA 進行凝集素染色，結 果如圖 3.9 所示。可發現 HA1 表面醣化有與半乳糖以 α-2,3 鍵結之唾液酸，而無 α-2,6 鍵結之唾液酸。另外，間質蛋白 (M1) 同時有 α-2,3 及 α-2,6 鍵結之唾液酸。

圖 3.10 為二次元電泳配合凝集素染色法，以 MAA 凝集素染色發現非毒性與毒性 株中，HA1 最鹼性的異構物，都只有被 MAA 輕微染到，而 pI 較低的 5 個異構物 則有很深的染色。另外，在二次元電泳圖譜中在原先的 6 個異構物左側，也偵測到 α-2,3 鍵結之唾液酸，這些蛋白質點的蛋白質量很小，但卻被清楚染到唾液酸的存 在。而在 SNA 凝集素染色的實驗中，HA1 並未被染色，此結果和一維電泳結果相 符。總和以上實驗結果得知，HA1 多種等電點異構物可能是由 HA1 醣質含有 α-2,3 鍵結之唾液酸所造成。

3.4.3 以高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 配合脈衝式安培法偵測器 (PAD) 分析 HA1 醣基之唾液酸

為了解 HA1 表面醣化之唾液酸為何種亞型，使用 CarboPac PA-10 陰離子交換 管柱，配合 HPAEC-PAD 進行實驗。首先以禽流感病毒進行 SDS-PAGE 並轉印至 PVDF 膜上，剪切出 HA1 蛋白質條帶，接著進行唾液酸水解酶酶切，釋出唾液酸，

進行 HPAEC-PAD 分析。圖 3.11 a 為三種亞型之唾液酸標準品的分離，可發現此方 法可以清楚分離三種亞型之唾液酸。圖 3.11 b, c 為 HA1 經唾液酸解酶酶切並進行 HPAEC，結果無偵測到唾液酸。本實驗無法偵測到唾液酸，可能是因為唾液酸的量 過小，或是神經胺酸酶並無水解唾液酸，抑或是唾液酸並不存在於 HA1 之醣質。

3.4.4 以凝集素染色法分析經唾液酸酶水解後之 HA1

由於結果 3.4.1 中，發現神經胺酸水解酶會影響 HA1 之 6 個異構物，且結果 3.4.2 中，以凝集素染色法發現 HA1 可能有唾液酸化，但於結果 3.4.3 中，唾液酸酶處理 HA1 後以 HPAEC 無法偵測到唾液酸，因此開始懷疑 HA1 上是否真的存在唾液酸。

本實驗將唾液酸酶處理過之病毒，以凝集素染色法分析，發現隨著唾液酸酶處理時間愈 長，HA1 之蛋白質量漸少，並從酶切 24 hr 後開始，在 36 kD 形成新的蛋白質條帶，

經由質譜定序分析後發現此蛋白質亦為 HA1，且此條帶也可結合 MAA，圖 3.12。因 此推論，HA1 可能在酶切過程中降解，因此 HA1 蛋白質量會減少；而經由唾液酸酶 酶切過後，無論是 50 kD 或 35 kD 之 HA1 皆可結合 MAA，則表示唾液酸酶並無作 用，亦或是 HA1 本身並無唾液酸修飾，也就是說 MAA 與 HA1 醣質為非專一性結 合。為了解 HA1 確切之醣質結構，實驗接著進行建構 HA1 之醣質表現圖譜。

a b

no sialidase sialidase 1 hr

sialidase 4 hr sialidase 24 hr

e

sialidase 48 hr f

pH 3 pH 10

sialidase 48 hr western blot

Figure 3.8 Neuraminidase treatment of the virulent (2838V) avian influenza viruses

a b c

Figure 3.9 Sialyoglicoproteins were detected by MAA and SNA. Asialofetuin and fetuin were used as negative (-) and positive (+) controls, respectively

a b

Figure 3.10 Sialyoglycoproteins were analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and MAA/SNA lectins

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 -20

50 100 160nC

min 1.8

2.4

3.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0

-20 50 100 150 220nC

min 1.8

2.4

3.0 5.0

NeuNAc

NeuGAc KDN

2838N HA1

2838V HA1 a

b

c

圖 3.11 以高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 配合脈衝式安培法偵測器 (PAD) 分析 血液凝集素 1 (HA1) 表面醣化中之唾液酸亞型

Figure 3.11 Sialic acid composition in HA 1 was analyzed by high performance anion-exchange chromatography (HPAEC), coupled with pulsed amperometric detection (PAD)

a b c Figure 3.12 Lectin blotting analysis of HA1 after sialidase treatment

3.5 血液凝集素 1 (HA1) 之醣質表現圖譜

HA1 有 4 至 6 個可能之 N-醣基化位置 (N-glycosylation sites) (圖 3.4 b)，本實驗 以 凝 集 素 染 色 為 基 礎 之 QIAGEN 醣 晶 片 分 析 HA1 之 醣 質 ， 接 著 使 用 MALDI-TOF/TOF 質譜儀，研究 HA1 之醣質表現圖譜。

3.5.1 使用醣晶片分析 HA1 之醣質

本實驗利用 Qproteome GlycoArray Kit 分析 HA1 之醣質，此醣晶片各點固定 了特定之凝集素，若 HA1 之醣質可和固定之凝集素結合，配合 HA 之單株抗體以 及帶有螢光之二次抗體，即可得知 HA1 醣質之概況。結果如圖 3.13 所示，首先 HA1 之醣質可能有 N-複雜型 (N-complex type) 之結構，如二分支 (biantennary) 和 三、四分支 (tri-/tetraantennary) 等複雜結構。次之 HA1 可能有 N-醣基之核心甘露 醣 (mannose) 或是 high-mannose 型之醣結構。接著 HA1 醣鏈之尾端可能是半乳糖 (galactose) 或 N-乙醯半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine)。另外，HA1 有 β 半乳糖 (β-galactose) 訊號顯示，表示 HA1 有部分之醣鏈之末端為半乳糖，且無接上唾液 酸。而醣晶片也發現 HA1 之醣質有岩藻醣基化 (fucosylation) 之現象。最後，HA1 有被偵測到大量的唾液酸訊號 (sialic acid)，表示 HA1 除了有部分半乳糖或 N-乙醯 半乳糖胺作為醣鏈末端的醣質之外，亦有許多以唾液酸為末端之醣質。而此醣晶片 若是唾液酸之訊號過強，則會導致 β 半乳糖、N-乙醯半乳糖胺及 N-乙醯葡萄糖胺之 訊號較為低落 (Qproteome glycoarray handbook)，此現象亦可在圖 3.13 發現。偵測 到大量之唾液酸訊號，表示 HA1 有一種以上之醣基末端為唾液酸，而此以凝集素 染色為基礎之醣晶片，快速的提供了 HA1 醣質之概況，可輔助 3.5.3 質譜儀之醣 質體分析。

3.5.2 使用 HPLC 配合螢光偵測器分析 HA1 之醣質

HA1 只 有 N-glycans 而 無 O-glycans ， 本 實 驗 將 HA1 之 N-glycans 以 PNGase F 於電泳膠體內酶切釋放，接著以 2-aminobenzamide 進行螢光標定，並使 用 HPLC 分析 HA1 之醣質，流程如圖 3.14 a 所示。結果顯示 HA1 有 10 種左 右不同大小之 N-glycans，圖 3.14 b。

3.5.3 以 MALDI-TOF/TOF MS 及 MS/MS 研究 HA1 之醣質表現圖譜

本實驗利用質譜儀進行 HA1 醣質定序與醣質體之質譜分析，實驗流程如圖 3.15 所示。首先以二次元電泳分離 6 種 HA1 之異構物，接著切下 HA1 各蛋白質點進 行膠內水解後，使用 PNGase F 釋放 N-glycans，並以 Sep-Pak C18 小柱分離胜肽鏈 及醣質，接著將分離的醣質泛甲基化後，以 MALDI TOF/TOF MS 及 MS/MS 進行 醣質定序。圖 3.13 為 MALDI TOF/TOF MS 比較病毒株最鹼性之 HA1 異構物之醣 質差異。結果顯示，兩株病毒株並無明顯差異圖 3.16。毒性病毒株最鹼性之 HA1 異 構物經由 MALDI MS 分析後 (圖 3.17 a)，選出三組 m/z 值分別為 1579.8、1867.0

和 2489.2 作為前驅者 (precursor)，進行 MS/MS 之醣質定序，可得到圖 3.17 呈現 之醣質結構。

首先，m/z 1579.8 之醣質為 5 個 mannose 之 high mannose type 醣鏈 (圖 3.17

首先，m/z 1579.8 之醣質為 5 個 mannose 之 high mannose type 醣鏈 (圖 3.17