使用 HPAEC-PAD 分析唾液酸亞型

小型真空離心機 (Thermo, SpeedVac) 37°C 恆溫箱 (Memmert)

藥品試劑：

Neuraminidase (Roach，Cat. No. 11 080 725 001) 方法步驟：

1) 使用 60 µg 病毒蛋白進行電泳後，將蛋白質轉印到 PVDF 膜上，並剪切下 目標蛋白質。

2) 加入 80 µl 之神經胺酸水解酶，於 37°C 反應 48 hr。

3) 將 PVDF 膜取出後，以 SpeedVac 於 40°C 抽乾。

4) 抽乾後之唾液酸於 -20°C 保存備用。

2.8.2 使用 HPAEC-PAD 分析唾液酸亞型 儀器用具：

ICS 3000 (Dionex)

Chromatography system Gradient Pump

Electrochemical Detector Autosampler

Chromeleon chromatography software (Dionex)

CarboPac PA10 Analytical Column (2 x 250 mm) (Dionex)

Filter (Millex-GV PVDF membrane，0.22 µm、4 mm ) 藥品試劑：

N-Acetylneuraminic acid (Neu5Ac) (Sigma) N-Glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) (Sigma)

3-Deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid (KDN) (Toronto Chemicals) Sodium hydroxide, 50% (w/w) (Fisher Scientific)

Sodium Acetate (Merck) 100 mM Sodium Hydroxide

100 mM Sodium Hydroxide/1 M Sodium Acetate 方法步驟：

1) 裝置並以 100 mM NaOH 流洗 CarboPac PA10 及其 guard column。

2) 使用 100 µl 二次水回溶樣本，過濾，裝入樣本瓶後，裝入 autosampler。

3) 使用軟體設定以下程式，並設定流速為 0.25 mL/min

(Dionex Technical note 41) 4) 啟動程式，待程式終止後，以軟體分析。

2.9 蛋白質身分鑑定

2.9.1 膠體內蛋白酶水解 儀器用具：

平台震盪器 (TKB, OS701)

微量高速離心機 (Beckman, Microfuge) 小型真空離心機 (Thermo, SpeedVac) 超音波震盪器 (Branson, Sonicater) 37°C 恆溫箱 (Memmert)

試劑藥品：

Ammonium bicaronate 緩衝溶液

NH4HCO3 (0.25 M) (Sigma) 2.43 g

調 pH 至 8.5，補二次水至 100 mL，使用前加入 DTT 1.54 mg/mL 或 IAA 17.5 mg/mL

蛋白質脫色液：

NH₄HCO₃ (25 mM) (Sigma) ACN (50%) (Labscan) pH 8.5

酵素緩衝液：

NH4HCO3 (0.2 N) (Sigma) 1.94 g CaCl2 (0.5 mM) (Sigma) 5.5 mg 加二次水至 100 mL。

萃取溶液：

TFA (0.1%) (Merck) 0.1 mL

ACN (60%) (Labscan) 60 g 加二次水至 100 mL。

DTT (dithiothreitol) (USB)

IAA (iodoacctamide) (Amersham) 方法步驟：

1) 膠體經 CBR 染色後，以二次水清洗二次，每次 2 h。

2) 將目標蛋白質點從膠片上割下，放入經甲醇清洗過之微量離心管中。

3) 加入 100 µL 10 mM DDT/25 mM ammonium bicarbonate，pH 8.5 緩衝溶液中，

在 37°C 下反應 1 h。

4) 以 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 DTT。

5) 加入 100 µL 100 mM iodoacetamide (IAA)/25 mM ammonium bicaronate，pH 8.5 緩衝溶液，於室溫避光反應 1 h。

6) 以 10,000 rpm 離心 1 min 以去除 IAA。

7) 加入蛋白質脫色液，於 30°C 反應 15 min，重複兩次。

8) 以二次水清洗兩次，每次 10 min，以去除 CBR，最後以 SpeedVac 抽乾。

9) 加入含有 0.1 µg trypsin 之酵素緩衝液 10 µL，水解反應 10 min。

10) 再加入 100 µL 酵素緩衝液，於 37°C 下反應隔夜。

11) 加入 200 µL 萃取溶液。

12) 在 35~40°C 下超音波震盪 30 min，收集萃取液於微量離心管中，重複一次。

13) 用 SpeedVac 抽乾。

2.9.2 以質譜儀鑑定蛋白質點身分 儀器用具：

ESI-Q-TOF (Micromass) 方法步驟：

1) 將經 2.5.1 處理之樣本，送交鐠德科技股份有限公司以 ESI-Q-TOF 質譜儀分 析。

2) 將送回之原始資料傳送至 Mascot 資料庫平台比對蛋白質身分，主要比對資 料庫為 MSDB 或 NCBInr。

2.10 高效能層析儀 (HPLC) 配合螢光偵測器分析 N-醣質

2.10.1 醣質之膠內水解釋放及螢光標定 儀器用具：

65°C 水浴槽 (Kansin instruments) 試劑藥品：

N-Glycosidase F (PNGase F) (BioLabs) N-Glycosidase F 之酵素緩衝液:

25 mM ammonium bicarbonate，pH 8.5 (Sigma) TFA (Merck)

ACN (Labscan)

2-aminobenzamide (Merck) Acetic acid (J.T.Baker) DMSO (Sigma)

Sodium cyanoborohydride (Merck) 冷凍乾燥機

微量高速離心機 (Beckman, Microfuge)

方法步驟：

1) 膠體經 CBR 染色後，參考方法 2.9.1 將 CBR 去除。

2) 加入含有 3 unit N-Glycosidase F 之酵素緩衝液，於 37°C 反應 72 hr。

3) 加入 500 µl 100% ACN/2%TFA，超音波震盪 15 分鐘，離心蒐集上清液。

4) 加入 500 µl 50% ACN/1%TFA，超音波震盪 15 分鐘，離心蒐集上清液。

5) 加入 500 µl 0.1%TFA/ddH20，超音波震盪 15 分鐘，離心蒐集上清液。

6) 重複步驟 5。

7) 加入 500 µl 100% ACN 震盪，離心取上清液。

8) 將前步驟上清液集中，以 10,000 rpm 離心 1 min，取上清液進行冷凍乾燥。

9) 將 1.5 mg 2AB 加入 100 µl 之 30% acetic acid/DMSO 中，混合均勻。

10) 再加入 5.15 mg sodium cyanoborohydride，混合均勻。

11) 吸取 15 µl 步驟 10 配製之試劑，回溶乾燥之醣質，於 65°C 避光反應 3hr。

2.10.2 使用 HPLC 分析 N-glycans 儀器用具：

TSKgel amide-80 column (TOSOH) HITACH L-7100 pump

螢光偵測器 (Waters 2475)

3) 使用軟體設定以下程式，並定流速為 1 mL/min，excitation 330 nm, emission 420 nm

Column: TSKgel amide-80

Detection: fluorescence detector Flow rate: 1 mL/min

Eluent: A. 20% 50 mM NaOAc/ACN B. 50 mM NaOAc Sep-Pac C18 column (Waters)

藥品試劑：

N-Glycosidase F 之酵素緩衝液:

25 mM ammonium bicarbonate，pH 8.5 (Sigma) N-Glycosidase F (PNGase F) (BioLabs)

Acetonitrile (ACN) (J.T.Baker) Formic acid (Sigma)

方法步驟：

NaOH (J.T.Baker) DMSO (Sigma)

CH₃I (KANIO chemical) CHCl3 (J.T.Baker)

方法步驟：

2.11.3 以質譜儀分析 N-glycans 儀器用具：

小型真空離心機 (Thermo, SpeedVac) MICROMASS MALDI MicroMX (Waters) 藥品試劑：

70% methanol

2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 方法步驟：

1) 以 200 µL 70% methanol 回溶醣質，吸取至 1.5 mL 微量離心管，並以 SpeedVac 抽乾。

2) 將醣鏈以 70% methanol 回溶，並以基質溶液 (DHB，20 mM sodium acetate) 稀釋至 3 µL，將樣本點至 MALDI plate 上，真空乾燥後，進行 MALDI TOF/TOF 質譜分析

第三章 結果

本論文研究源起於 2000 年，王金和老師實驗室分離出台灣本土 H6N1 禽流感病 毒株 (A/Chicken/Taiwan/2838/00)，而 2838 病毒株經由病毒的毒性強弱又可分為兩種 亞型，非毒性 (2838N) 及毒性 (2838V) 病毒株 ⁶¹。毒性及非毒性禽流感病毒株之八段 基因已於 2002 年完成定序工作，而兩病毒株之間胺基酸序列之差異如表 3.1 所示 ⁶⁴。

為了解兩病毒株之蛋白質體間之差異，本論文使用二次元電泳配合本實驗室製備 之 HA 單株抗體 ⁶² 進行免疫染色分析比對。發現兩病毒株之血液凝集素 1 (HA1) 皆 有 6 種不同等電點的異構物，為了解異構物形成之原因，實驗轉向蛋白質之轉譯後修 飾。

表 3.1 非毒性與毒性 2838 禽流感病毒株各基因之間胺基酸序列的差異 ⁶⁴

Table 3.1 Comparison of amino acid sequences from the genes of non-virulent and virulent 3838 avian influenza viruses strains ⁶⁴

經由胺基酸序列比對發現，非毒性及毒性之禽流感病毒株之八段基因中，血液凝集 素 (HA) 之差異度最大 (1.41%)，而間質蛋白 1 (Matrix protein 1) 之序列並無差異。

3.1 比較非毒性與毒性禽流感病毒株之間蛋白質體的差異

使用由雞胚胎之尿囊液純化出之禽流感病毒，以 10% TCA/Acetone 沉澱其蛋白 質，並進行二維電泳，使用 Coomassie blue 及硝酸銀染色法比對非毒性與毒性 AIV 蛋 白質體之差異。結果發現 HA1 為二維圖譜上差異最大之蛋白質點。接著使用血液凝集 素 (HA) 單株抗體進行免疫染色，發現非毒性及毒性 AIV 之 HA1 皆有 6 種不同等 電點之異構物。

3.1.1 兩株 2838 禽流感病毒二次元電泳圖譜之比較

本實驗使用病毒全蛋白進行二次元電泳分析，比較非毒性 (2838N) 與毒性 (2838V) 禽流感病毒株之蛋白質體。圖 3.1 a，b 使用 Coomassie blue 染色，並以質 譜儀進行蛋白質份鑑定，可在蛋白質圖譜中發現最為豐富的三種蛋白質。第一種為 佔蛋白質總量最大之間質蛋白 1 (M1)，M1 分子量約 24 kD 為結合流感病毒 RNA 之蛋白質，因此 M1 富含鹼性胺基酸，其位於圖譜中 pH 10 的位置，但事實上 M1 等電點可能大於 10。第二種為核殼蛋白 (NP)，NP 約 60 kD 其本身為包覆 RNA 的 蛋白質，因此其本身等電點亦可能超過 10。第三種為血液凝集素 (HA)，圖譜中可 發現分子量約 130 kD 之 HA0，50 kD 之 HA1 及 25 kD 之 HA2。圖 3.1 c，d 為圖 3.1 a，b 之膠片進行硝酸銀染色的結果，可發現更多蛋白質點，這些蛋白質有些來 自病毒本身，有些來自於病毒增殖用之雞胚胎。比較非毒性與毒性禽流感病毒株之 蛋白質體可發現差異最大的為 HA1 之蛋白質群點。

3.1.2 血液凝集素重鏈 (HA1) 為兩禽流感病毒株蛋白質圖譜上差異最大之蛋白質

血液凝集素 (HA) 為非毒性 (2838N) 與毒性 (2838V) 禽流感病毒株之胺基酸 序列差異度 (1.41%) 最大的蛋白質，而在二次元蛋白質圖譜中，血液凝集素重鏈 (HA1) 亦為差異最大的蛋白質，非毒性株 HA1 等電點較毒性株低。圖 3.2 為兩株 病毒 HA 以 BLAST 進行分析之結果，可發現 16 個胺基酸之訊號胜肽中有 1 個 胺基酸不同；而 HA2 的 222 個胺基酸中有 5 個胺基酸不同，但這 5 個胺基酸之 不同，並未使兩株病毒之 HA2 在二次元蛋白質圖譜中產生明顯差異；反觀 HA1，

HA1 在 329 個胺基酸中只有 2 個不同，但此 2 個胺基酸差異卻使非毒性與毒性株 之 HA1 相差 3 個電荷。2838N 中 HA 之第 106 個胺基酸為酸性的麩胺酸 (Glu)，但 2838V 為中性的甘胺酸 (Gly)；另外，2838N 之第 304 個胺基酸為酸性 的麩胺酸 (Glu)，但 2838V 卻為鹼性的離胺酸 (Lys)，而 HA 之第 106 及 304 個胺 基酸，就是 HA1 在 329 個胺基酸中僅有的兩個不同，此差異造成兩株病毒之 HA1 相差三個電荷。以 EMBOSS IEP 軟體預測 HA1 之等電點得知，2838N 之 HA1 等 電點為 6.8764；2838V 之 HA1 等電點為 7.9163，此預測結果可和蛋白質二維圖譜 HA1 之蛋白質群點互相呼應，也就是非毒性株 HA1 之等電點較毒性株低，可能源 自於蛋白質一級結構。

3.1.3 非毒性與毒性 AIV 之 HA1 皆有 6 種不同等電點之異構物

雖然兩株病毒之 HA1 等電點差異甚大，但皆有 6 種不同等電點之異構物。圖 3.3 使用 HA 單株抗體進行免疫染色，再次證實。延續 3.1.2 中 HA1 等電點之預 測，2838N 之 HA1 等電點為 6.8764；2838V 之 HA1 等電點為 7.9163，此二預測 之 pI 值，恰好是 HA1 在蛋白質圖譜的 6 個點中，pI 值最大的點，也就是最鹼性 的蛋白質點。因此推測其餘 5 個 pI 值較小，較偏酸性之 HA1 異構物，可能是由不 同程度之蛋白質轉譯後修飾使 HA1 酸化所造成。

a b

Figure 3.1 Comparison of the total proteins from the non-virulent and virulent avian influenza viruses by 2-DE

Signal peptide -5

106 Near the receptor binding site

304

332/333 381

419

541 HA1

HA2

Cleavage site

Receptor binding site

Signal peptide: 16 amino acids HA1: 329 amino acids HA2: 222 amino acids

Predict glycosylation sites

圖 3.2 BLAST 比對非毒性與毒性 2838 禽流感病毒株血液凝集素之胺基酸序列 之差異

Figure 3.2 Alignment of the sequences of hemagglutinin between non-virulent and virulent 2838 avian influenza viruses

圖 3.3 以免疫染色檢定血液凝集素 1 (HA1) 在非毒性與毒性禽流感病毒株之二 次元圖譜得知，HA1 有 6 種不同等電點之異構物

Figure 3.3 Immunoblot analysis of hemagglutinin 1 on the 2-DE PAGE revealed six pI isoforms of HA1

a

pH 3pH 3 pH 10pH 10

b

pH 3pH 3 pH 10pH 10

170 130 100 72

55

40

33

24

17

170 130 100 72

55

40

33

24

17

Non-virulent virulent

3.2 探究血液凝集素 1 (HA1) 有 6 種不同等電點異構物之原因

為了解 HA1 形成 6 種異構物之原因，實驗轉向研究可能影響蛋白質等電點之轉 譯後修飾。

3.2.1 預測血液凝集素 1 (HA1) 之蛋白質轉譯後修飾

蛋 白 質 之 磷 酸 化 (phosphorylation) ， 醣 基 化 (glycosylation) 以 及 硫 酸 鹽 化 (sulfation)，都有可能使蛋白質之等電點變小、變酸。圖 3.4 a 使用 NetPhos 2.0 軟體 預測 HA1 可能之磷酸化修飾，發現兩株病毒之 HA1 皆可能有 21 個可能被磷酸 化修飾之胺基酸位置，其中 8 個為 Ser、 8 個為 Thr，5 個為 Tyr。圖 3.4 b 使用 NetGlyc 1.0 軟 體 預 測 HA1 可 能 之 N- 醣 基 化 位 置 ， 發 現 共 有 6 處 為 Asn-X-Ser/Thr 可能之 N-醣基化位置，而其中有 4 處為可能性更高之醣基化預測位 置 (圖中紅色之 N)。圖 3.4 c 使用 Sulfinator 軟體預測可能之 Tyr 硫酸鹽化之位 置，發現 HA1 並無可能之硫酸鹽化位置。

3.2.2 實驗設計

由於 3.2.1 預測之結果，發現 HA1 可能有 phosphorylation 及 glycosylation，

而醣基化若接上酸性醣，如廣泛存在之唾液酸，則有可能影響蛋白質之等電點，

因此實驗設計配合酶切、二次元電泳、免疫染色及凝血素染色及質譜儀分析，探究 HA1 形成 6 種異構物，是否為蛋白質磷酸化，或是醣基化所造成，圖 3.5。

a

b Non-virulent

virulent

Non-virulent

virulent

c Non-virulent virulent

圖 3.4 以軟體預測可能使 HA1 等電點變小之轉譯後修飾 Figure 3.4 Post-translational modification prediction of HA1

A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)

Purified virus

Dephosphorylation

Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP)1 U/30 µg

protein, 37℃ for 48 hr

Desialylation

Neuraminidase (sialidase) 0.04 U / 30 µg protein, 37℃ for

1-72 hr

Total protein precipitation with 10% TCA/Aceton

Two-dimensional electrophoresis (2-DE)

Phosphoproteome Western Blot

Anti-phospho-Ser/Thr/Tyr

In-gel digestion of excised protein spots for ESI-QUAD-TOF mass spectrometric characterization

Sialoglycoproteins Lectin Blot

MAA (α2-3); SNA (α2-6)

圖 3.5 以可能影響血液凝集素 1 (HA1)等電點之轉譯後修飾作用進行實驗設計

Figure 3.5 Experimental design based on the hemagglutinin 1 post-translational modifications that influence pI values

3.3 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 並非蛋白質磷酸化所造成

3.3 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 並非蛋白質磷酸化所造成

在文檔中 臺灣本土禽流感病毒株血液凝集素重鏈異構物分析及其醣質表現圖譜 (頁 37-0)