第三章 結果
3.5 紅血球凝集素 (HA1) 之醣質表現圖譜
3.5.3 以 MALDI-TOF/TOF MS 及 MS/MS 研究 HA1 之醣質表現圖
本實驗利用質譜儀進行 HA1 醣質定序與醣質體之質譜分析，實驗流程如圖 3.15 所示。首先以二次元電泳分離 6 種 HA1 之異構物，接著切下 HA1 各蛋白質點進 行膠內水解後，使用 PNGase F 釋放 N-glycans，並以 Sep-Pak C18 小柱分離胜肽鏈 及醣質，接著將分離的醣質泛甲基化後，以 MALDI TOF/TOF MS 及 MS/MS 進行 醣質定序。圖 3.13 為 MALDI TOF/TOF MS 比較病毒株最鹼性之 HA1 異構物之醣 質差異。結果顯示，兩株病毒株並無明顯差異圖 3.16。毒性病毒株最鹼性之 HA1 異 構物經由 MALDI MS 分析後 (圖 3.17 a)，選出三組 m/z 值分別為 1579.8、1867.0
和 2489.2 作為前驅者 (precursor)，進行 MS/MS 之醣質定序，可得到圖 3.17 呈現 之醣質結構。
首先，m/z 1579.8 之醣質為 5 個 mannose 之 high mannose type 醣鏈 (圖 3.17 a)；而 m/z 1867 之醣質為 m/z 1579.8 之醣質再加上一個 m/z 287.2 之物質，將此 未知物質稱為 X，此醣質稱為 X-glycan (圖 3.17 b)；而 m/z 2489.2 之醣質為 N-複 雜型 (N-complex type) 之三分支 (tri-antennary) 結構 (圖 3.17 c)。
而使用上述三個醣質之確切結構，則可由 MALDI MS 之結果 (圖 3.16) 推測出 其餘醣質之結構。表 3.2 為 HA1 十個主要醣質之組成及結構分析，可發現 m/z 2070.3 及 m/z 2244.4 為 N-複雜型之二分支 (bi-antennary) 醣質，其中 m/z 2244.4 較 m/z 2070.3 多一個 fucose；m/z 2489.2、m/z 2693.6 及 m/z 2867.8 為 N-複雜型 之三分支 (tri-antennary) 醣質，其中 m/z 2489.2 為確切解出之結構，m/z 2693.6 較 m/z 2489.2 多一個 fucose，m/z 2693.6 較 m/z 2867.8 多出兩個 fucose；m/z 2968.8、
m/z 3143.0 及 m/z 3317.2 為 N-複雜型之四分支 (tetra-antennary) 醣質，m/z 3143.0 較 m/z 2968.8 多一個 fucose，m/z 3317.2 較 m/z 2968.8 多兩個 fucose。
另外，使用 MALDI TOF/TOF MS 比較各 HA1 異構物之醣質差異，可發現等電 點越低，也就是越酸之 HA1 異構物，其 m/z 1867 之 X-glycan 含量比例越高，如 圖 3.18 所示。表 3.3 為 HA1 異構物各醣質之含量比較。
圖 3.13 利用 Qproteome 醣晶片分析血液凝集素 1 (HA1) 之醣質
Figure 3.13 Qproteome GlycoArray Kit analysis for the glycan of hemagglutinin 1 (HA1)
a
b
Virus purification
Protein separation (SDS-PAGE)
Glycans were released with PNGase F within gel Extraction of N-glycans
2-aminobenzamide (2AB) labeling
Separation of N-glycan by HPLC with fluorescence detection
mV
Column: TSKgel amide-80 Detection: fluorescence detector Flow rate: 1 mL/min
Eluent: A. 20% 50 mM NaOAc/ACN B. 50 mM NaOAc
Figure 3.14 HPLC analysis of fluorescence-labeled HA1 N-glycans of virulent strain
Virus purification Protein separation (2-DE)
Trypsin in-gel digestion of glycoproteins Extraction of peptides
Removing N-glycans from glycopeptides with PNGaseF Separation of peptides and oligosaccharides by Sep-Pak C18 column
MALDI-TOF MS/MS protein ID permethylation of glycans
N-Glycan profiling by MALDI- TOF/TOF MS/MS peptides oligosaccharides
Virus purification Protein separation (2-DE)
Trypsin in-gel digestion of glycoproteins Extraction of peptides
Removing N-glycans from glycopeptides with PNGaseF Separation of peptides and oligosaccharides by Sep-Pak C18 column
MALDI-TOF MS/MS protein ID permethylation of glycans
N-Glycan profiling by MALDI- TOF/TOF MS/MS peptides oligosaccharides
圖 3.15 醣質定序與醣質體之質譜分析流程 Figure 3.15 Workflow of N-glycans profiling
2838N HA1
pH low high pH low high
2838V HA1
pH low high pH low high
圖 3.16 MALDI MS 比較毒性與非毒性禽流感病毒株 HA1 之醣質表現圖譜.
Figure 3.16 Comparison by the MALDI TOF/TOF MS glycan profiles for hemagglutinin 1 between 2838N and 2838V
B1,5XMan
a m/z 1579.79
b m/z 1866.99
X
X: m/z 287.20
1792.67 1677.20 1268.81 860.54 615.39
m/z
0,4XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XGalNAc type structure
1792.67 1677.20 1268.81 860.54 615.39
m/z
0,4XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XMan
1,5XGalNAc type structure
X X
X
X X
c m/z 2489.20
Figure 3.17 MALDI MS/MS analysis of HA1 N-glycans of virulent strain a. 以 m/z 1579 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS
b. 以 m/z 1867 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS c. 以 m/z 2489 之醣鏈做為前驅者，進行 MS/MS
Hex7HexNAc6Fuc2 Table 3.2 The N-glycans of HA1
a
Intens: 1.25 : 1
Intens: 3.08 : 1 :
X-glycan
Intens: 1.76 : 1
Intens: 2.53 : 1
Intens: 3.18 : 1
pH low high pH low high
pH low high pH low high
pH low high pH low high
pH low high pH low high pH low high pH low high
pH low high pH low high pH low high pH low high pH low high pH low high X-glycan :
b
圖 3.18 比較 HA1 異構物之間 X-醣鏈之差異
Figure 3.18 Comparison for the X-glycans between HA1 isoforms
2838V
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
m/z
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
% total Intens.
m/z
表 3.3 比較非毒性與毒性禽流感病毒株之 HA1 異構物之間醣質比例之差異 Table 3.3 Comparison for the N-glycans ratio of HA1 between 2838N and 2838V