血液凝集素重鏈 (HA1) 為兩禽流感病毒株蛋白質圖譜上差異最

使用由雞胚胎之尿囊液純化出之禽流感病毒，以 10% TCA/Acetone 沉澱其蛋白 質，並進行二維電泳，使用 Coomassie blue 及硝酸銀染色法比對非毒性與毒性 AIV 蛋 白質體之差異。結果發現 HA1 為二維圖譜上差異最大之蛋白質點。接著使用血液凝集 素 (HA) 單株抗體進行免疫染色，發現非毒性及毒性 AIV 之 HA1 皆有 6 種不同等 電點之異構物。

3.1.1 兩株 2838 禽流感病毒二次元電泳圖譜之比較

本實驗使用病毒全蛋白進行二次元電泳分析，比較非毒性 (2838N) 與毒性 (2838V) 禽流感病毒株之蛋白質體。圖 3.1 a，b 使用 Coomassie blue 染色，並以質 譜儀進行蛋白質份鑑定，可在蛋白質圖譜中發現最為豐富的三種蛋白質。第一種為 佔蛋白質總量最大之間質蛋白 1 (M1)，M1 分子量約 24 kD 為結合流感病毒 RNA 之蛋白質，因此 M1 富含鹼性胺基酸，其位於圖譜中 pH 10 的位置，但事實上 M1 等電點可能大於 10。第二種為核殼蛋白 (NP)，NP 約 60 kD 其本身為包覆 RNA 的 蛋白質，因此其本身等電點亦可能超過 10。第三種為血液凝集素 (HA)，圖譜中可 發現分子量約 130 kD 之 HA0，50 kD 之 HA1 及 25 kD 之 HA2。圖 3.1 c，d 為圖 3.1 a，b 之膠片進行硝酸銀染色的結果，可發現更多蛋白質點，這些蛋白質有些來 自病毒本身，有些來自於病毒增殖用之雞胚胎。比較非毒性與毒性禽流感病毒株之 蛋白質體可發現差異最大的為 HA1 之蛋白質群點。

3.1.2 血液凝集素重鏈 (HA1) 為兩禽流感病毒株蛋白質圖譜上差異最大之蛋白質

血液凝集素 (HA) 為非毒性 (2838N) 與毒性 (2838V) 禽流感病毒株之胺基酸 序列差異度 (1.41%) 最大的蛋白質，而在二次元蛋白質圖譜中，血液凝集素重鏈 (HA1) 亦為差異最大的蛋白質，非毒性株 HA1 等電點較毒性株低。圖 3.2 為兩株 病毒 HA 以 BLAST 進行分析之結果，可發現 16 個胺基酸之訊號胜肽中有 1 個 胺基酸不同；而 HA2 的 222 個胺基酸中有 5 個胺基酸不同，但這 5 個胺基酸之 不同，並未使兩株病毒之 HA2 在二次元蛋白質圖譜中產生明顯差異；反觀 HA1，

HA1 在 329 個胺基酸中只有 2 個不同，但此 2 個胺基酸差異卻使非毒性與毒性株 之 HA1 相差 3 個電荷。2838N 中 HA 之第 106 個胺基酸為酸性的麩胺酸 (Glu)，但 2838V 為中性的甘胺酸 (Gly)；另外，2838N 之第 304 個胺基酸為酸性 的麩胺酸 (Glu)，但 2838V 卻為鹼性的離胺酸 (Lys)，而 HA 之第 106 及 304 個胺 基酸，就是 HA1 在 329 個胺基酸中僅有的兩個不同，此差異造成兩株病毒之 HA1 相差三個電荷。以 EMBOSS IEP 軟體預測 HA1 之等電點得知，2838N 之 HA1 等 電點為 6.8764；2838V 之 HA1 等電點為 7.9163，此預測結果可和蛋白質二維圖譜 HA1 之蛋白質群點互相呼應，也就是非毒性株 HA1 之等電點較毒性株低，可能源 自於蛋白質一級結構。

3.1.3 非毒性與毒性 AIV 之 HA1 皆有 6 種不同等電點之異構物

雖然兩株病毒之 HA1 等電點差異甚大，但皆有 6 種不同等電點之異構物。圖 3.3 使用 HA 單株抗體進行免疫染色，再次證實。延續 3.1.2 中 HA1 等電點之預 測，2838N 之 HA1 等電點為 6.8764；2838V 之 HA1 等電點為 7.9163，此二預測 之 pI 值，恰好是 HA1 在蛋白質圖譜的 6 個點中，pI 值最大的點，也就是最鹼性 的蛋白質點。因此推測其餘 5 個 pI 值較小，較偏酸性之 HA1 異構物，可能是由不 同程度之蛋白質轉譯後修飾使 HA1 酸化所造成。

a b

Figure 3.1 Comparison of the total proteins from the non-virulent and virulent avian influenza viruses by 2-DE

Signal peptide -5

106 Near the receptor binding site

304

332/333 381

419

541 HA1

HA2

Cleavage site

Receptor binding site

Signal peptide: 16 amino acids HA1: 329 amino acids HA2: 222 amino acids

Predict glycosylation sites

圖 3.2 BLAST 比對非毒性與毒性 2838 禽流感病毒株血液凝集素之胺基酸序列 之差異

Figure 3.2 Alignment of the sequences of hemagglutinin between non-virulent and virulent 2838 avian influenza viruses

圖 3.3 以免疫染色檢定血液凝集素 1 (HA1) 在非毒性與毒性禽流感病毒株之二 次元圖譜得知，HA1 有 6 種不同等電點之異構物

Figure 3.3 Immunoblot analysis of hemagglutinin 1 on the 2-DE PAGE revealed six pI isoforms of HA1

a

b

170 130 100 72

55

40

33

24

17

170 130 100 72

55

40

33

24

17

Non-virulent virulent

3.2 探究血液凝集素 1 (HA1) 有 6 種不同等電點異構物之原因

為了解 HA1 形成 6 種異構物之原因，實驗轉向研究可能影響蛋白質等電點之轉 譯後修飾。

3.2.1 預測血液凝集素 1 (HA1) 之蛋白質轉譯後修飾

蛋 白 質 之 磷 酸 化 (phosphorylation) ， 醣 基 化 (glycosylation) 以 及 硫 酸 鹽 化 (sulfation)，都有可能使蛋白質之等電點變小、變酸。圖 3.4 a 使用 NetPhos 2.0 軟體 預測 HA1 可能之磷酸化修飾，發現兩株病毒之 HA1 皆可能有 21 個可能被磷酸 化修飾之胺基酸位置，其中 8 個為 Ser、 8 個為 Thr，5 個為 Tyr。圖 3.4 b 使用 NetGlyc 1.0 軟 體 預 測 HA1 可 能 之 N- 醣 基 化 位 置 ， 發 現 共 有 6 處 為 Asn-X-Ser/Thr 可能之 N-醣基化位置，而其中有 4 處為可能性更高之醣基化預測位 置 (圖中紅色之 N)。圖 3.4 c 使用 Sulfinator 軟體預測可能之 Tyr 硫酸鹽化之位 置，發現 HA1 並無可能之硫酸鹽化位置。

3.2.2 實驗設計

由於 3.2.1 預測之結果，發現 HA1 可能有 phosphorylation 及 glycosylation，

而醣基化若接上酸性醣，如廣泛存在之唾液酸，則有可能影響蛋白質之等電點，

因此實驗設計配合酶切、二次元電泳、免疫染色及凝血素染色及質譜儀分析，探究 HA1 形成 6 種異構物，是否為蛋白質磷酸化，或是醣基化所造成，圖 3.5。

a

b Non-virulent

virulent

Non-virulent

virulent

c Non-virulent virulent

圖 3.4 以軟體預測可能使 HA1 等電點變小之轉譯後修飾 Figure 3.4 Post-translational modification prediction of HA1

A/chicken/Taiwan/2838N/00 (H6N1) A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1)

Purified virus

Dephosphorylation

Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP)1 U/30 µg

protein, 37℃ for 48 hr

Desialylation

Neuraminidase (sialidase) 0.04 U / 30 µg protein, 37℃ for

1-72 hr

Total protein precipitation with 10% TCA/Aceton

Two-dimensional electrophoresis (2-DE)

Phosphoproteome Western Blot

Anti-phospho-Ser/Thr/Tyr

In-gel digestion of excised protein spots for ESI-QUAD-TOF mass spectrometric characterization

Sialoglycoproteins Lectin Blot

MAA (α2-3); SNA (α2-6)

圖 3.5 以可能影響血液凝集素 1 (HA1)等電點之轉譯後修飾作用進行實驗設計

Figure 3.5 Experimental design based on the hemagglutinin 1 post-translational modifications that influence pI values

3.3 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 並非蛋白質磷酸化所造成

本段實驗接續 3.2 之實驗設計，研究 HA1 異構物形成的原因是否為蛋白質磷酸化 所致。實驗分別以鹼性磷酸酶處理禽流感病毒，以及使用抗磷酸化抗體進行免疫染色。

3.3.1 以鹼性磷酸酶處理禽流感病毒株並進行二次元電泳

本實驗使用鹼性磷酸酶處理病毒蛋白質，結果如圖 3.6 所示。在鹼性磷酸酶酶 切 48 小時後，HA1 蛋白質群點並無明顯變化，而 M1 分子量有明顯下降，比較控 制組及酶切組，可清楚分別磷酸化及去磷酸化之 M1。

3.3.2 以抗磷酸抗體進行二次元電泳之免疫染色

本實驗首先進行禽流感病毒之二次元電泳，接著轉印至 PVDF 膜並使用抗磷酸 抗體進行免疫染色，偵測磷酸化蛋白質。實驗結果如圖 3.7 所示，可發現 HA1 蛋 白質群點之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr) 並無磷酸化，另使用 anti-phosph-Tyr 單株 抗體偵測，發現在 ECL 呈色後，並無任何訊號，因此 HA1 之酪胺酸 (Tyr) 可能無 磷酸化，亦或是此株抗體失效。另外，實驗發現和 3.3.1 鹼性磷酸酶酶切結果相符，

間質蛋白 1 (M1) 之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr)有磷酸化現象。而 NP 之絲胺酸 (Ser) 及酥胺酸 (Thr) 亦有明顯磷酸化。此外，二次元圖譜上約 100 kD 之 RNA 聚 合酶 A (RNA polymerase A，簡稱 PA) 之酥胺酸 (Thr) 有磷酸化，而藉由此實驗，本 實驗室第一次確定 PA 在二次元圖譜上的位置。配合 3.3.1 及本段結果得知，不同 等電點異構物之 HA1 並非由蛋白質磷酸化所造成。

a b

A: phosphorylated M1 B: dephosphorylated M1

圖 3.6 以鹼性磷酸酶處理非毒性與毒性禽流感病毒株並進行二次元電泳 Figure 3.6 Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP) treatment of total proteins of

the virulent and non-virulent avian influenza viruses

a b c

d e f

Anti-phospho-Ser Anti-phospho-Thr Anti-phospho-Tyr

M1

Figure 3.7 Immunoblot analysis of virus protein with anti-phospho-Ser, anti-phospho-Thr ,and anti-phospho-Tyr antibodies

3.4 不同等電點異構物之血液凝集素 1 (HA1) 可能是由其醣質之唾液酸修飾所造成

本段實驗接續 3.2 之實驗設計，研究 HA1 異構物形成的原因是否為醣蛋白質表面 醣基化之唾液酸修飾。實驗首先以神經胺酸水解酶 (neuraminidase, NA) 處理病毒全蛋 白質，發現 HA1 蛋白質點受酶切影響，接著使用凝集素染色法 (lectin blot)，發現 HA1 之醣質可能有 α-2,3 鍵結之唾液酸，最後企圖使用高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 分析唾液酸之亞型。

3.4.1 以神經胺酸水解酶處理禽流感病毒株並進行二次元電泳

以神經胺酸水解酶處理病毒全蛋白質 1 至 48 小時後，進行二次元電泳，銀染 後可發現，隨著處理時間的增長，HA1 蛋白質群點由等電點高至低，依序消失，如 圖 3.8 a-e 所示。酶切 1 小時後，HA1 蛋白質群點並無變化；4 小時後最鹼性之蛋 白質點消失；24 小時後，等電點最高的兩個點消失；48 小時後，等電點較高之 5 個 異構物消失。在酶切 48 小時後，使用質譜儀進行蛋白質身份鑑定，發現新產生之 24 kD 蛋白質為間質蛋白 1 (M1)，圖 3.8 f。而經酶切 48 小時後，進行二維電泳並 轉印至 PVDF 膜上，以 HA 單株抗體進行免疫染色，可發現等電點較高之 HA1 無 法被偵測，而酶切後之 HA1 亦無法由免疫染色偵測。雖然本實驗和預期結果不符，

但由 HA1 蛋白質群點由等電點高至低，依序消失的現象可得知，神經胺酸水解酶會 影響 HA1 之 6 個異構物。

3.4.2 以凝集素染色法 (lectin blot) 發現 HA1 之醣質可能有 α-2,3 鍵結的唾液酸 得知神經胺酸水解酶會影響 HA1 蛋白質群點後，繼續使用凝集素染色法 (lectin blot)，欲直接證明唾液酸的存在。使用的凝集素有兩種，第一種為 Maackia amurensis agglutinin (MAA)，可偵測唾液酸 α-2,3-半乳糖鍵結；第二種凝集素為 Sambucus nigra agglutinin (SNA)，可偵測唾液酸 α-2,6-半乳糖鍵結。實驗首先進行 SDS-PAGE 並轉染至 PVDF 膜上，接著使用 MAA 及 SNA 進行凝集素染色，結 果如圖 3.9 所示。可發現 HA1 表面醣化有與半乳糖以 α-2,3 鍵結之唾液酸，而無 α-2,6 鍵結之唾液酸。另外，間質蛋白 (M1) 同時有 α-2,3 及 α-2,6 鍵結之唾液酸。

圖 3.10 為二次元電泳配合凝集素染色法，以 MAA 凝集素染色發現非毒性與毒性 株中，HA1 最鹼性的異構物，都只有被 MAA 輕微染到，而 pI 較低的 5 個異構物 則有很深的染色。另外，在二次元電泳圖譜中在原先的 6 個異構物左側，也偵測到 α-2,3 鍵結之唾液酸，這些蛋白質點的蛋白質量很小，但卻被清楚染到唾液酸的存 在。而在 SNA 凝集素染色的實驗中，HA1 並未被染色，此結果和一維電泳結果相 符。總和以上實驗結果得知，HA1 多種等電點異構物可能是由 HA1 醣質含有 α-2,3 鍵結之唾液酸所造成。

3.4.3 以高效能陰離子交換層析儀 (HPAEC) 配合脈衝式安培法偵測器 (PAD) 分析 HA1 醣基之唾液酸

為了解 HA1 表面醣化之唾液酸為何種亞型，使用 CarboPac PA-10 陰離子交換

為了解 HA1 表面醣化之唾液酸為何種亞型，使用 CarboPac PA-10 陰離子交換