非選擇性與選擇性培養基

本實驗以 Andersen 1-STG 隨機搭配非選擇性培養基 TSA 與四種適用於 S.

aureus 之選擇性培養基 MSA、BPA、CSA 與 CSM 於暴露艙進行 6 分鐘之空氣採 樣，並以其空氣採樣濃度與其採樣前後Nebulizer 中菌液濃度平均值之比值（R）， 顯示其採樣效能。統計結果顯示，TSA 之採樣效能顯著高於 MSA、BPA、CSA 與 CSM 之採樣效能，此結果意味著在相同採樣條件（採樣器、抽氣流量、相對濕度 與採樣時間）下，相較於選擇性培養基，無添加任何抑菌成份之非選擇性培養基 可培養出較多 S. aureus 生物氣膠。Stewart 等人曾以 Andersen six stage sampler 搭 配非選擇性（TSA）與選擇性培養基（MacConkey agar 與 TSA plus 5% NaCl），於 暴露艙中對 Pseudomonas fluorescens（ATCC 13525）（適用之選擇性培養基為 MacConkey agar）與 Micrococcus luteus（ATCC 4698）（適用之選擇性培養基為TSA plus 5% NaCl）進行15 分鐘之空氣採樣，而後計數培養基上菌落數以計算回收率

（Relative recovery, %）。其結果顯示，P. fluorescens 氣膠於 TSA 與 MacConkey agar 之回收率分別為20±4%與 0%，而 M. luteus 氣膠於 TSA 與 TSA plus 5% NaCl 之回 收率則分別為 14±3%與 13±1%。該研究指出生物氣膠以衝擊方式收集至培養基上 時，可能造成菌體結構損傷或喪失部分生理功能，致使較脆弱細菌（P. fluorescens）

於選擇性培養基上的回收率下降（Stewart et al. 1995）。

然 2011 年 Hsiao 等人發現非選擇性 TSA 與選擇性培養基 CSA 對於 S. aureus 生物氣膠之回收率相似。該研究使用的係與本研究相同之 S. aureus（ATCC 29213）， 其實驗過程係以Andersen 1-STG 搭配不同培養基於暴露艙進行 7 分鐘空氣採樣，

而後計數菌落數以計算不同培養基之採樣效能（Relative recovery, RR；等同於本研 究之R）。其結果顯示，於相對溼度RH 為 55%時，TSA 與 CSA 之 RR 值相似（0.5-0.9）

（Hsiao et al. 2011）。而本研究 TSA 與 CSA 之採樣效能分別為 0.139 與 0.061，且 TSA 採樣效能顯著高於 CSA。推測造成兩者差異之可能原因包括：不同的生物氣 膠採樣器評估系統（如： Nebulizer 之壓力（Hsiao 等人為 20 psi）、系統總流量（Hsiao 等人為50 L/min）、連接 Nebulizer 與暴露艙之管線長度與材質等）、不同的空氣採 樣時間（Hsiao 等人為 7 分鐘）以及採樣結束至 37℃培養之時間間隔等。

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7.2.1.2 選擇性培養基

本實驗結果中，四種選擇性培養基之 R 值彼此間雖無顯著差異，然比較數據 後可發現MSA 之 R 值最高，BPA 次之，而 CSM 之 R 值最低。本研究於四種選擇 性培養基中選擇其一進行生物氣膠採樣方法之效能評估，除考量其 R 值，亦將文 獻中對於其成分、Sensitivity 與 Specificity 或 S. aureus 回收率（Recovery）等因子 納入參考。

在 CSM 部分，其成分與篩選原理皆與 MSA 相近，然關於其鑑定準確度或 Recovery 之研究相當有限，觀察過往於實場環境進行 S. aureus 空氣採樣後之樣本 處置方法發現，研究者以Andersen sampler 搭配 TSA（Gandara et al. 2006）或 NA

（Perez et al. 2011）完成空氣採樣並將 TSA 與 NA 培養一至二日後，再將生長之 菌落接種至CSM 並接續培養二日，其後再進行生化鑑定。雖然兩篇文獻的作者並 未說明為何以接種方式培養至CSM 而未直接以 CSM 進行空氣採樣，然以本研究 實驗結果而論，因其採樣效能最低，上述兩篇文獻之做法亦是本研究建議使用CSM 培養基之方式，亦即先以非選擇性培養基進行空氣採樣以獲得高採樣效能，再接 種至空氣採樣效能相對較差之CSM，以進行後續生化鑑定。此作法的優點係可避 免因培養基採樣效能較低，致使於空氣採樣過程中損失較多具可培養性之 S. aureus，

致使研究者低估環境空氣中 S. aureus 之濃度；然其缺點為耗時且鑑定過程較為繁 瑣。

在 MSA、BPA、CSA 與 CSM 部分，1995 年 Sato 等人發現對於泳池中之水樣，

BPA、MSA、CSM、Vogel Johnson 與 m-Staphylococcus agar 等培養基之 S. aureus 回收率分別為 28.6%、22.9%、21.0%、19.1%、11.4%（表 20），然五種培養基之 回收率未達統計上顯著差異（Sato et al. 1995）。該研究在MSA、BPA 與 CSM 之回 收率統計結果與本研究之採樣效能相似（MSA、BPA 與 CSM 之 R 值分別為 0.085

±0.01、0.069±0.01 與 0.061±0.01），三者間均未達顯著差異。2010 年 Kim 與 Oh 亦 有近似發現，該研究以MSA、BPA、Vogel johnson、RAPID’Staph 與 CSA 等五種 培養基測試米飯與魚肉中之 S. aureus 之回收率，結果發現回收率分別為 63.3%、

70.0%、56.7%、53.3%、50.0%（表 20），且五種培養基之回收率亦無統計上顯著 差異（Kim and Oh 2010）。上述結果顯示，環境水樣與食品中之 S. aureus 於三種培 養基中被分離並培養出來之能力相近。水樣或食品之採樣過程及樣本前處理步驟

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雖與空氣樣本相異，且 S. aureus 於水體或食品中之生理特性與其存在空氣中亦可 能不同，然上述兩研究各自針對同類型樣本、以相同前處理步驟評估不同培養基 對於環境水體與食品中 S. aureus 之回收率，亦可作為後續實場空氣採樣分析時選 擇培養基之參考。

值得注意的是，2010 年 Kim 與 Oh 之研究亦評估 BPA、MSA、Vogel johnson、

RAPID’Staph 與 CSA 之對於米飯與魚肉中 S. aureus 之鑑定能力，結果顯示除 MSA 之Sensitivity 與 Specificity 分別為 96.5%與 66.6%外，其他四種培養基中皆為 100%

（表 20），亦即BPA、MSA 與 CSA 之 S. aureus 回收能力相當，然 MSA 之鑑定準 確度不足（Kim and Oh 2010）。其中 BPA 部分，其內含 1%之 Sodium pyruvate 可 促進具活性然不具可培養性（viable but non- culturable, VBNC）之 S. aureus 於培養 基中分離（Saito et al. 2011），原理係因 S. aureus 受熱或乾燥致使其catalase 活性下 降時，Sodium pyruvate 將有助於減少peroxide 於此過程中對S. aureus代謝功能之 影響（Baird-Parker et al. 1965）。然 DeBuyser 等人研究指出，一般而言，乳製品中 之汙染雜菌濃度較高，當以BPA 分析 77 件乳製品樣本中之 S. aureus，其中有 18 件（23.4%）出現陽性菌落數過多以致無法計數之現象，然於分析相同樣本之 rabbit plasma fibrinogen agar（RPFA）medium 中，僅有 2 件（2.6%）樣本出現上述現象，

因此推論BPA 對抑制雜菌生長之能力需要進一步被評估（De Buyser et al. 1995）。

上述結果顯示BPA 對不同食品類型之鑑定能力有所差異，其與樣本處理過程與食 品中所含細菌濃度皆有關係，因此對於可能混合多種菌群之空氣樣本中 S. aureus 之鑑定準確度是否能如Kim 與 Oh 之研究結果，亦需進一步被評估。

CSA 部分，其確切成分為製造廠商之機密，故無從得知。2001 Carricajo 等人 以 CSA 對臨床血液、尿液與上呼吸道等檢體進行 S. aureus 鑑定，結果顯示其 Sensitivity 與 Specificity 分別為 98%與 100%（Carricajo et al. 2001）（表 20），以上 結果與Kim 等人之研究皆顯示 CSA 對於食品與臨床樣本具有良好 S. aureus 鑑定能 力。然2011 年 Hsiao 等人以 Andersen 1-STG 搭配 CSA 於暴露艙對 S. aureus 進行 7 分鐘之空氣採樣時，結果如前述，其採樣效能與 TSA 無統計上顯著差異：然其 於醫療院所以相同採樣條件進行空氣採樣時，CSA 對 S. aureus 之鑑定 Sensitivity 與Specificity 分別為 24.1%與 91.2% (Hsiao et al. 2011)（表 20），其低敏感性可能 與環境中不同來源之菌種其生物活性差異有關（Perez et al. 2003），而此亦為未來

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於實際環境以選擇性培養基進行 S. aureus 空氣採樣時可能面臨之問題，屆時恐需 搭配適當生化測試以提高鑑定敏感性。

雖過往文獻（Kim and Oh 2010）指出 MSA 對於食品中 S. aureus 之鑑定能力 相對於BPA 與 CSA 等培養基不足，然本研究中 MSA 於四種選擇性培養基中採樣 效能最高，其應與內含之7.5% NaCl 有關（Chapman 1945）。過去文獻指出，添加 7.5% NaCl 於一般廣效性固體培養基時，致病性葡萄球菌屬（Staphylococci）可於 其上生長良好，並可有效抑制非葡萄球菌屬（non-Staphylococci）的生長；此外，

在37℃下培養 Staphylococci 於內含 7.5% NaCl 之 bacto phenol red mannitol agar 12 小時後，其Staphylococci 凝固酶（coagulase）活性上升；另於 proteose lactose agar 添加7.5% NaCl 時，除可抑制雜菌生長，亦可促進 Staphylococci 產色原（chromogen）

與凝固酶活性，因此可作為保存Staphylococci 之最佳培養基（Chapman 1945）。除 高濃度鹽分外，MSA 配方中之 peptones 與牛肉衍生物（beef extract）可提供微生 物生長之氮源、有機碳、維他命及無機鹽類之來源。換言之，MSA 本身富含 S. aureus 生長所需之營養成分，且其內含之高鹽分除可抑制其他菌種與 S. aureus 競爭培養 基養分，亦可促進 S. aureus 之生物活性，推測上述成分是 MSA 於四種選擇性培養 基中具最佳採樣效能之因素。而於其鑑定能力而言，MSA 於臨床樣本中 S. aureus 之Sensitivity 與 Specificity 不容小覷。2006 年 Sharp 與 Searcy 指出，MSA 為長期 被使用於肺囊性纖維化（CF）病患之呼吸道檢體之選擇性培養基，研究發現 200 件檢體於MSA 進行四區劃線培養後，於未加做其他鑑定測試之情況下，有大於 98%

之樣本顯示只要第二區出現菌落則最後鑑定即為 S. aureus（Sharp and Searcy 2006）。

此外，2013 年 Bautista-Trujillo 等人對牛奶樣本進行 S. aureus 鑑定，結果顯示於其 他測試項目皆相同之情況下，以 MSA 作為 S. aureus 初步分離之培養基時，其 Sensitivity、Specificity、NPV 與 PPV 皆為 100%（表 20），而CSA 之 Sensitivity、

Specificity、NPV 與 PPV 則分別為 92.31%、94.46%、99.09%與 75%（Bautista-Trujillo et al. 2013），亦即若以 MSA 取代 CSA 將使該測試流程具更高之 S. aureus 鑑定能 力。上述研究與Kim 與 Oh 研究結果相異，雖同樣分析食品中 S. aureus，然食品 種類與樣本處理過程不同亦可能影響鑑定結果。

綜合以上研究，可知於分析臨床或食品樣本時，MSA 本身即提供良好之鑑定 能力，且輔以其他測試後，其鑑定結果之Sensitivity、Specificity、NPV 與 PPV 皆

88 上產色原作用而呈現陽性結果（Hsiao et al. 2011）。故本研究選擇四種選擇培養基 中具最佳採樣效能、充足養分、並能維持甚至促進 S. aureus 生長活性之培養基收

R(This study) 0.085±0.01 0.069±0.01 0.066±0.01 0.061±0.01 Sensitivity(%) 100 96.5 100 92.31 98 24.1 100 - MSA 之具高 Sensitivity 與 Specificity 之鑑定方法，並同時評估其鑑定所需時間與 成本，以期達到準確並有效率鑑定 S. aureus 與 MRSA 之目的。

影響鑑定結果之因子包括細菌之生物活性與其測試項目等（Kateete et al. 2010）