第三章 材料與方法
第四節 以聚合酶連鎖反應（PCR）增幅標的核酸片段
聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)是一種以核酸生物化學為基礎的 分子生物學技術，應用於菌種鑑定發展迄今約廿年時間，利用此技術可由極少的菌量 中分離出分枝桿菌的核酸，再以特定的核酸片段做為連鎖反應的引子(primer)，於特 定溫度條件設定下在微量試管中反覆進行變性(denature)、鍛化(annealing)、延伸 (extention)循環，每次循環即可將原檢體中萃取出的標的核酸片段數量增幅 2 倍，如 此連續循環增幅35 次即可增幅標的核酸片段 235倍。
一、核酸萃取(DNA extraction)
以 NucleoSpin Tissue 套組(Macherey-Nagel)及建議之分枝桿菌核酸萃取步 驟操作，套組中含有T1 溶解緩衝液(Lysis buffer T1)、B1 緩衝液（Buffer B1）、 B2 緩衝液（Buffer B2）、B5 清洗緩衝液(Wash Buffer B5)、BW 清洗緩衝液 (Wash Buffer BW)、BE 溶離緩衝液(Elution Buffer BE)、K 蛋白酶(Proteinase K)、PB 蛋白酶緩衝液（Proteinase Buffer PB）、B3 溶解緩衝液(Lysis buffer B3) 等商業配方。
MGIT 陽性並且抗酸性染色陽性轉殖於蛋基培養基斜面之長成菌落 2~4 個，以二次純水清洗2 次，3,000×g 離心 15 分鐘後倒除上清液並吸取其沉渣 約100 μl；加入 180 μl B1 緩衝液（Buffer B1）及 25 μl K 蛋白酶(Proteinase K) 後強力震盪混合均勻，置於56℃恆溫乾浴槽直到翌日(overnight)；取出檢體
試管加入B3 溶解緩衝液(Lysis buffer B3)200 μl 並強力震盪後置於 70℃恆溫 乾浴槽10 分鐘；取出檢體試管再加入 210 μl 純酒精(100％) 並強力震盪；最 後將檢體滴入於套組所附之特殊試管中，以冷凍離心機11,000×g 超高速離 心1 分鐘即完成分枝桿菌核酸萃取程序。
二、聚合酶連鎖反應（PCR）
(一)引子(primer)
本研究所採用針對分枝桿菌屬高度專一性的引子(primer) TB11 (5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’) 與 TB12（5’-CTTGTCGAACCGC ATACCCT-3’），前述引子購自 IDT 生物科技公司（Integrated DNA Technologies corp.USA）(Pai. et al., 2003a)。
(二)變性(denature)、鍛化(annealing)、延伸(extention)循環
參酌相關文獻關於 PCR 循環的條件設定，應用 TB11 及 TB12 兩 種引子Taq聚合酶、dNTP （2X ReddyMixTM PCR Master Mix購自 Thermo Scientific, ABgene corp. UK）作為反應基質條件針對分枝桿菌 屬專一基因組(genome)－hsp65 的反應溫度及時間，大致上有兩種設 定：
1、35 個增幅循環 94℃15 秒鐘的變性反應(denature)、55℃30 秒鐘的 鍛化反應(annealing)、72℃60 秒鐘的延伸反應(extention) (Pai et al., 2003a)。
2、45 個增幅循環 94℃1 分鐘的變性反應(denature)、60℃1 分鐘的鍛 化反應(annealing)、72℃1 分鐘的延伸反應(extention)。
聚合酶連鎖反應的特性增幅循環越多次，理論上當然越容易將極
微量的標的核酸序列增幅放大為有意義且可偵測的訊號，但同時也將 可能使得原本無意義的雜訊變的有意義而造成偽陽性，因此本研究採 用第一種增幅條件設定，因為其增幅循環 35 次較之於第二種條件增 幅循環 45 次較不易出現偽陽性。本研究採用之聚合酶連鎖反應溫度 循環機為 Mastercycler gradient Authorized Thermal Cycler（eppendorf corp. USA）。
（三）經前述條件進行聚合酶連鎖反應後的產物以 3％電泳膠電泳分析該檢 體是否含有非結核性分枝桿菌屬核酸，乃依據在紫外光下電泳膠片上 435bp 位置是否存在訊號而定，若出現 435bp 位置的訊號則代表該檢 體含有非結核性分枝桿菌屬菌種，反之則無。
電泳膠的處理分析所需之材料如下：
1. 電泳膠粉(Agarose gel powder，購自 Thermo Scientific, ABgene corp. UK)
2.迷你水平電泳槽（Mini Gel System MJ-105, BioProducts Corp.
Taiwan）
3.核酸染劑(Ethidium Bromide)
4.紫外燈箱(附相機)（SCOPEWD, TOPBIO Corp. Taiwan）
5.電泳標示標準液(Marker Bio-100 Mass DNA Ladder，購自台灣波仕 特生物科技公司)
6.緩衝液 10X TB buffer（自行配製）：
Tris 18.2 g
溶於 60 ml 二次水
以 HCl 調 pH 至 6.8 加水至 100 ml
（四）每個樣本需進行 PCR 之各項試劑配方及用量：
PCR Master mix.25 μl、核酸萃取液 3 μl、TB11 及 TB12 引子各 1 μl、二次 純水 20μl，加入 0.2 毫升微量反應試管後充分混合即可置入 Mastercycler gradient Authorized Thermal Cycler（Eppendorf corp. USA）依設定之條件進行
PCR 反應。