高雄市長期照護機構環境中美洲蟑螂及德國蟑螂體內外分布之分枝桿菌研析

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(1)國立高雄大學運動健康與休閒學系碩士論文. 高雄市長期照護機構環境中美洲蟑螂及德國蟑螂體內外分布之分枝桿菌研析 A Study of Mycobacterium of Periplaneta americana and Blattella germanica around the Long-Term Care Organizations in Kaohsiung City. 研究生：潘炤穎指導教授：白秀華. 撰教授. 中華民國 99 年 7 月.

(2) 高雄市長期照護機構環境中美洲蟑螂及德國蟑螂體內外分布之分枝桿菌研析 A Study of Mycobacterium of Periplaneta americana and Blattella germanica around the Long-Term Care Organizations in Kaohsiung City.

(3) 誌謝作學問是一輩子的志業...依稀記得在 15 年前長庚醫學院的畢業典禮上，當時的校長吳德朗教授這樣勉勵 84 級的畢業生，年少輕狂的我絲毫不覺得這句話的份量，直到踏進職場才發覺處處皆是學問，不論是學術專業、為人處世、待人接物、應對進退...等各方面，在離開校園 13 年後正式重拾書本踏入學術殿堂之時，想起這句話更覺格外珍貴。能以年近不惑的「高齡」順利完成碩士學程，首要必需感謝一路上提攜栽培我的老師－白秀華教授，從 92 年登革熱防治業務上的請益開始，白老師的縝密周詳與一絲不苟的研究精神，就一直是我心嚮往之的學者風範，也是您啟迪了我ㄧ窺學術堂奧的興趣，印象最深刻的就是每每課堂上聽完白老師的諄諄教誨，總會使所有的同學在百般挫折的研究中重燃對於學術的熱情以及對於社會的關懷；此外、對於台大名譽教授、台灣昆蟲學界「大老」－徐爾烈教授的耐心指導亦在此一併誌謝，您溫文儒雅、雍容大度的大師風範，以及對於學術研究的執著、熱情與悉心更是學生後進們學習的典範！「仰之彌高、鑽之彌堅」、「望之儼然、即之也溫」我想是對於兩位敬愛的老師在我心中最貼切中肯的印象了。還有大學時期公共衛生、流行病學的啟蒙老師－張吳名任教授，雖然現在已經辭世遠去了但對於我仍是意義重大。在職進修的路是崎嶇不平的，市立民生醫院謝院長敬崇、內科部薛主任榮海、實診科陳主任文財、高雄市政府衛生局韓前局長明榮、企劃室陳主任惠珠、高雄市政府衛生局疾病管制處蔡前處長武雄、陳前處長文財、陳科長朝東等衛生局各級長官以及同事們的協助是維繫著一步步往前的主要動力；研究室的朝豐、俊宇、芮欖、俊豪更是經常在我兩頭燒的時候，義無反顧的協助我；同學們在學術上的切磋與砥礪是豐富多元的，並且經常激盪出炫目的火花－運健休 M96、M97、M98 的諸位...謝謝你們！這一路的辛苦與汗水，淬練出的將會是鋼鐵般的意志與耐力，那是值得的；還有不斷在這階段支持我、鼓勵我的好朋友們，你們的情意相挺我衷心的感激。最重要的是感謝本研究中所有配合我們叨擾的高雄市長期照護機構，我們這段時間的努力不會白費，相信未來會更美好。末、僅以拙作呈為獻禮，呈予我最親愛的家人－我的愛妻－若無妳的蘭心慧質、極大限度的包容與支持、若無妳加倍費心的照顧稚子，我絕對無法在這時候順利完成碩士學程；我的父、母－有你們的鼓勵與培育才有現在的我，我會好好的走下去的...；還要分享喜悅給在這期間溘然長逝的祖母－我終於畢業了，您在天之靈該也是甚感欣慰吧！ 2010.07.20 謹誌於高雄市立民生醫院分子生物學實驗室. I.

(4) 高雄市長期照護機構環境中美洲蟑螂及德國蟑螂體內外分布之分枝桿菌研析指導教授：白秀華教授國立高雄大學運動健康與休閒學系學生：潘炤穎國立高雄大學運動健康與休閒學系摘要本研究目的係藉由調查高雄市立案的長期照護機構環境中之蟑螂，其體內外所分離出的非結核性分枝桿菌，及生活其中的住民臨床檢體，以明瞭其在環境中分佈和蟑螂之病媒潛能。於高雄市 69 家（75%）安養及養護機構以捕蟑盒誘捕蟑螂，共捕獲 558 隻美洲蟑螂 119 隻（21.3%）、德國蟑螂 439 隻（78.7%）；分別抽樣並萃取其體內外之灌洗液共計 516 個（46.24%）檢體，且取得住民臨床檢體 51 個，進行分枝桿菌的培養、分離與鑑定。經 BATEC MGIT 960 培養系統 6 週後，共得 37 個含有經抗酸性染色鏡檢，呈現分枝桿菌生長的陽性檢體，整體陽性率為 7.17％（37/516）；分別為蟑螂體外 21 個陽性檢體（56.76％， 21/37）、體內共 16 個陽性檢體（43.24％，16/37）；而住民臨床檢體陽性率為 1.96％（1/51）。選取液態培養基呈現分枝桿菌陽性檢體轉殖於固態培養基並俟其長成菌落後，以核酸增幅限制酶片段分析（PCR-RFLP）分子生物學檢驗方法，針對 hsp65 基因段應用 TB11 及 TB12 兩種引子（primer）增幅 35 個循環之後，以 BstEⅡ、HaeⅢ兩種限制酶（restriction enzyme）切分其核酸增幅產物，再以 3％電泳膠分析之，獲得其結果為 M. trivale 7 株、 M. gordonae 3 株、M. szulgai 6 株、M. nonchronogencum II 3 株、M. abscessus 4 株、 M. flavesscens I 1 株。其他未能以上述兩種限制酶鑑別的 NTM 計 13 株。綜上所述，非結核性分枝桿菌因其廣泛的分布於生活環境之中，經蟑螂居家病媒傳播，造成長期照護機構年老住民或免疫功能不良者伺機性感染的可能性極高，故而有效防範長期照護機構住民或醫療機構患者遭受非結核性分枝桿菌侵襲的方法，應著重於日常的環境整潔衛生維護，居家蟑螂的管制工作尤其應列為常規重點項目之一。關鍵字：非結核性分枝桿菌、美洲蟑螂、德國蟑螂、長期照護機構. II.

(5) A Study of Mycobacterium of Periplaneta americana and Blattella germanica around the Long-Term Care Organizations in Kaohsiung City. Advisor: Professor Hsiu-Hua Pai Department of Kinesiology, Health, and Leisure Studies National University of Kaohsiung Student: Chao-Ying Pan Department of Kinesiology, Health, and Leisure Studies National University of Kaohsiung ABSTRACT This study is aimed to the determinate distribution of non-tuberculous Mycobacteria (NTM) of cockroaches as potential vectors around the long-term care organizations in Kaohsiung city. All NTM samples were isolated from either the intra- and extra-lavages of cockroaches or the inhabitants in the legal long-term care facilities of Kaohsiung city. Herein, 558 in numbers of cockroaches were caught, which existed commonly in sixty-nine (75%) long-term care organizations of Kaohsiung city. The NTM samples sources came from two different parts, one was 558 cockroaches, 119 (21.3%) and 439 (78.7%) of them were classified to Blattella germanica and Periplaneta Americana, respectively. The other part was fifty-one clinical inhabitants’ samples. The numbers of 516 (46.24%) of the intra- and extra-lavages of cockroach samples were extracted with normal saline. All NTM samples were cultured for six weeks in BATEC MGIT 960 culture system and Mycobacterium examination were performed by acid-fast stain analysis. The result showed that thirty-seven lavage samples were Mycobacterium positive and the total positive rate was 7.17%. In detail, twenty-one (21/37, 56.76%) and sixteen (16/37, 43.24%) of these Mycobacterium positive samples were extra- and intra-lavage samples, respectively. The Mycobaterium positive rate of the clinical inhibiants’samples was 1.96% (1/51). Furthermore, to identify the classification of non-tuberculous mycobacteria of acid-fast stain positive lavages samples of cockroach, the polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） analysis technology was used. Two primers, TB11 and TB12 were used in PCR program, and the DNA fragments were amplified after thirty-five thermo-cycles. III.

(6) All the PCR products were digested with two restriction enzymes, BstEII and HaeIII and analyzed by electrophoresis with 3% agarose gel. The electrophoresis results were certified that seven of M. trivale, three of M. gordonae, six of M. szulgai, three of M. nonchronogencum II, four of M. abscessus, and one of M. flavesscens. However, thirteen samples were not certified by these two enzymes. To sum up, NTM universally surrounds in our environment and can be spread out through the housed media, like cockroaches. Highly risk of opportune infection can be happened among the inhabitants of long-term care facilities or immuno-deficient patients. To prevent the NTM spread out in those long-term care facilities or hospitals, neatly clean and sanitation in daily should be noticed. Moreover, the restraints of the housed media should be listed in one of the important conventional rules. Keywords: Non-tuberculous Mycobacteria（NTM）, Blattella germanica, Periplaneta Americana, long-term care organization. IV.

(7) 目錄第一章. 緒論. 第一節研究背景 ……………………………………………………………………………1 第二節研究動機 ……………………………………………………………………………2 第三節研究目的 ……………………………………………………………………………3 第四節關鍵名詞解釋 ………………………………………………………………………3. 第二章. 文獻探討. 第一節蟑螂之病媒潛力 ……………………………………………………………………5 第二節非結核性分枝桿菌之流行病學意義 ………………………………………………7 第三節非結核性分枝桿菌之臨床意義……………………………………………………10. 第三章. 材料與方法. 第一節研究對象與樣本採集………………………………………………………………13 第二節檢體萃取與培養……………………………………………………………………14 第三節培養產物抗酸菌染色及鏡檢判讀…………………………………………………16 第四節以聚合酶連鎖反應（PCR）增幅標的核酸片段……………………………………18 第五節以限制酶片段長度多型性（RFLP）分析非結核性分枝桿菌之菌種………………21 第六節比對檢體採集處所以及非結核性分枝桿菌菌種分離成果 ……………………22. 第四章. 結果. 第一節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分佈之狀況…………………………………23 第二節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂體內外非結核性分枝桿菌之分離…………24 第三節高雄市安養及養護機構環境中分佈蟑螂且潛在非結核性分枝桿菌感染其住民之風險評估………………………………………26. 第五章. 討論. 第一節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分佈之狀況…………………………………27 第二節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分離之非結核性分枝桿菌種類及分佈……28 第三節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂體內外分離之非結核性分枝桿菌種類與蟑螂品種……………………………………………………29.

(8) 第四節高雄市安養及養護機構環境中分佈蟑螂且潛在非結核性分枝桿菌感染其住民之風險評估 ……………………………………………30. 第六章. 結論……………………………………………………………………………32. 第七章. 建議……………………………………………………………………………33. 中文參考文獻………………………………………………………………………………35 英文參考文獻…………………………………………………………………………………37.

(9) 表目錄表 1. 高雄市長期照護機構之蟑螂體內外非結核性分枝桿菌之分離結果…………………41. 表 2. 高雄市長期照護機構之蟑螂體內外非結核性分枝桿菌之分離結果（以養護中心或護理之家區分）…………………………………………………………42. 表 3. 高雄市長期照護機構之蟑螂體內外非結核性分枝桿菌之分離結果（以德國蟑螂或美洲蟑螂區分）…………………………………………………………43. 表 4. 高雄市長期照護機構之蟑螂體內外非結核性分枝桿菌之分離結果（以蟑螂體內或體外區分）………………………………………………………………44. 表 5. 高雄市長期照護機構捕獲分佈之蟑螂體內外培養分離非結核性分枝桿菌陽性率分析結果…………………………………………………………………45. 表 6. 高雄市長期照護機構捕獲分布之蟑螂體內外培養分離非結核性分枝桿菌清單………………………………………………………………………………46. 表 7. 聚合酶連鎖反應－限制酶長度片段多型性（PCR-RFLP）與非結核性分枝桿菌菌種鑑定對照表…………………………………………………47.

(10) 圖目錄圖 1. 捕蟑盒 …………………………………………………………………………………48. 圖 2. 高雄市長期照護機構分佈之蟑螂數量與其體內外非結核性分枝桿菌陽性數量……49. 圖 3. 高雄市長期照護機構分佈之蟑螂分離非結核性分枝桿菌菌種及百分比 ………50. 圖 4. 高雄市長期照護機構分佈美洲蟑螂與德國蟑螂與分離非結核性分枝桿菌陽性檢體數量比較圖…………………………………………………………………………………51. 圖 5. 高雄市長期照護機構分佈蟑螂體內與體外分離非結核性分枝桿菌菌種與數量比較圖 ……………………………………………………………………………………………52. 圖 6. 高雄市安養中心與護理之家分佈蟑螂之體內外分離出之非結核性分枝桿菌結果比較圖…………………………………………………………………………………………53. 圖 7. 高雄市長期照護機構分佈之美洲蟑螂與德國蟑螂體內外分離出非結核性分枝桿菌菌種與比例比較圖…………………………………………………………………………54. 圖 8. 未能分類非結核性分枝桿菌…………………………………………………………55. 圖 9. Mycobacteria trivale…………………………………………………………………56. 圖 10 Mycobacteria flavescens I………………………………………………………… 57 圖 11 Mycobacteria gordonae IV……………………………………………………………58 圖 12 Mycobacteria szulgai…………………………………………………………………59 圖 13 Mycobacteria nonchromogenicum II…………………………………………………60 圖 14 Mycobacteria abscessus………………………………………………………………61.

(11) 附錄附錄 1 潘炤穎、白秀華、曾朝豐（2009 年 11 月 8 日）。台灣醫事檢驗學會九十八年度年會暨學術發表會發表「高雄市養護機構環境中非結核性分枝桿菌的分離與鑑定」，台北市，國立台灣大學國際會議廳。附錄 2 潘炤穎、曾朝豐、白秀華（2010 年 1 月 27 日）。台灣醫院感染管制學會 2010 年年會暨學術發表會發表「高雄市長期照護機構住民感染環境中非結核性分枝桿菌的風險評估」，台北市，台北馬偕紀念醫院第二講堂。.

(12) 第一章緒論. 第一節. 研究背景. 感染人類而致病的分枝桿菌屬（Mycobacterium）其發現歷史可追溯自距今約二千多年前的古埃及時期，當時被製作風乾的木乃伊於現代醫學的理學檢查被發現骨骼出現病兆，與當前全世界盛行率與致死率最嚴重的傳染病－結核病狀相似，於是被推測該具木乃伊可能於生前曾感染分枝桿菌屬中的殺手菌種－結核分枝桿菌（ Mycobacteria tuberculosis ）（蕭終融，行政院農業委員會家畜衛生試驗所 http://vettech.nvri.gov.tw/Articles/publication/222.html ；行政院衛生署疾病管制局 http://www.cdc.gov.tw/mp.asp?mp=230）。除此之外，盛行於中世紀的「痲瘋病」（leprosy）又名「癩病」或「漢生病」（Hansen’s Disease ），其致病原亦於廿世紀被確認為分枝桿菌屬中的痲瘋分枝桿菌（Mycobacterium leprae）（傳染病防治工作手冊，2009），目前世上痲瘋病的正式歷史記載出現於西元前六百餘年的古印度宗教典籍，當中記載了患者末梢肢體包含手指及腳趾日復一日喪失知覺的症狀（行政院衛生署樂生療養院－漢生園地 http://vettech.nvri.gov.tw/Articles/publication/ 222.html）；自古以來凡是感染痲瘋分枝桿菌而導致痲瘋病的病患一向被視同極為骯髒的絕症而完全失去人的尊嚴，甚至將其圈禁在與世隔絕的環境中任其自生自滅，更有被恐慌的民眾架上火場活活燒死的，相關駭人聽聞的悲劇不勝枚舉，除了悲憐人性的黑暗外，真正去追究背後的元兇實為痲瘋分枝桿菌（Mycobacterium leprae）。歷史上分枝桿菌除了奪去難以估計的生命外，所造成對於人性的衝擊更是影響深遠；近代因為科技的發展，陸續發現了超過百種的分枝桿菌屬菌種，對於人畜健康所. 1.

(13) 造成的風險雖然尚未完全被證實，但其重要性已越來越為各界所重視。. 第二節研究動機非結核性分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacteria）的發現歷時不到百年，但相對於結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）及痲瘋分枝桿菌（Mycobacterium leprae）其重要性一直被忽略，在 1885 年 Mycobacteria smegmatis 初被發現的年代，非結核性分枝桿菌被普遍的認為是常存在環境中的腐生細菌，而當時對於人類而言非結核性分枝桿菌是「或許」會引起伺機性感染的低病原性微生物，此一觀念直到 1950 年代才因臨床上進一步證實可能導致嚴重的感染症並且難以治療（Falkinham, ＆ J.O., 3rd.，1996）而被顛覆；1980 年代「廿世紀黑死病」－愛滋病的盛行造成後天免疫不全症候群（AIDS）患者大增，並且在這些免疫力極度缺乏的病患身上廣泛的分離出鳥型分枝桿菌（Mycobacterium avium complex），非結核性分枝桿菌的重要性才廣泛的為醫學界所重視（D. Wagner & L.S. Young.,2004）。免疫機能低下的人體生理狀況不只發生在人體感染人類免疫不全病毒（HIV）發病而造成後天免疫缺乏症候群（AIDS）的情況下，隨著年歲增長、人體生理機能退化的正常老化現象也是導致免疫機能低下的主因之ㄧ（沈光漢等，2001），依據內政部戶政司人口結構統計資料顯示，台灣自 1992 年即邁入「高齡化社會」，老年人口（65 歲以上）族群比率向上逐年急遽攀升，全民健康保險制度下普及的醫療照護更是直接延長了平均餘命（國民健康局），復以台灣在 2009 年已成為全球出生率最低的國家，在可以預見的將來，人口年齡結構將呈現倒金字塔的失衡現象，於是老年人口的遲暮照護便將成為極為重要維繫社會安定的重點政策，「老有所終」將不再僅是家庭問題，而擴大成為國家社會層面的重大內政課題。有鑒於此、許許多多的安養及養護機構便. 2.

(14) 如雨後春筍般的林立，但是大量的老年人口密集聚居於一處，亦可能衍生一些公共衛生上的疑慮，政府權管機關雖已針對國內的安養及養護機構制定了相關的環境衛生管理標準（中華民國全國法規資料庫，2010），但非結核性分枝桿菌普遍存在於環境中若配合環境衛生不良導致蟑螂等病媒叢生，極可能使得生活其中的住民暴露在高度的非結核性分枝桿菌感染風險之下（Pai, H.H.,et. al.,2004)。. 第三節. 研究目的. 本研究的目的在於（一）藉由調查高雄市安養及養護機構家居環境中蟑螂體內外帶有非結核性分枝桿菌之分布狀況，（二）檢驗高雄市安養及養護機構住民臨床檢體 (含傷口、尿液等臨床檢體）感染非結核性分枝桿菌之狀況，（三）評估其住民感染非結核性分枝桿菌的風險；期望能影響眾多的安養及養護機構加強院內環境衛生維護以及病媒管制工作，甚至能以此為濫殤，由政府機關據以制定一系列完整而嚴密的監督機制監控其環境衛生條件，以維護廣大的老弱族群遲暮生命的尊嚴與品質。. 第四節. 關鍵名詞解釋. （一）非結核性分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacteria, NTM）：廣泛的分佈於自然界中，包含自然的水、儲用水、土壤、空氣中的懸浮氣霧、原生動物、動物及人類皆可能成為其傳染窩（reservoirs），對於人類、動物及鳥類而言，有許多非結核性分枝桿菌菌種為致病原(Primm, Lucero & Falkinham, 2004)。（二）美洲蟑螂（Periplaneta americana）與德國蟑螂（Blattella germanica）：為台灣地區居家環境中最常見的兩種蟑螂。美洲蟑螂多出沒於居家室內環境，其體紅棕色，大型，成蟲體長約 30～45 公釐。德國蟑螂廣泛的分佈於全世界，成蟲. 3.

(15) 體長約 12～16 公釐，為居家性蟑螂中最小型者；基本上以外型而論，兩者間差異甚大。（三）安養及養護機構：本研究中所稱之安養機構乃依據內政部社會司老人福利機構設立標準第二條第二款定義「安養機構：以需他人照顧或無扶養義務親屬或扶養義務親屬無扶養能力，且日常生活能自理之老人為照顧對象。」，併同法第三章第廿五條至第三十條法規定設置之老人福利機構謂之，地方政府主管機關為高雄市政府社會局。本研究中所稱之養護機構乃依據衛生署護理機構分類設置標準第二條第二款定義，併同法第八條護理機構設置標準表「一般護理之家」謂之，地方政府主管機關為高雄市政府衛生局。. 4.

(16) 第二章文獻探討「非結核性分枝桿菌於高雄市安養及養護機構廣泛的分佈於環境中，可能藉由高群棲密度蟑螂為病媒而傳播於聚居其中的老人或病患」此為本研究的探討重點，為確立此一論點之合理性於本章文中分三小節探討之，分別為：蟑螂之病媒潛力、非結核性分枝桿菌之流行病學意義、非結核性分枝桿菌之臨床意義。. 第一節. 蟑螂之病媒潛力. 蟑螂為目前生存於地球上最古老的生物之一，其可能出現的年代據考古學家發現的化石推估，應可追溯至三億五千萬年以前的時代，在歷經無數次自然界嚴酷的考驗後蟑螂仍然可以生存在於當今世上，可以想見其生命力已淬煉的強韌異常，而現今地球上已知的蟑螂約有四千餘種，絕大部分分布於熱帶雨林之中，但不論是酷熱的乾燥沙漠地區、以及冰封盈呎的寒帶地區、皆可見蟑螂的蹤跡，僅有少數幾種蟑螂侵入人類居家環境中，目前台灣可見的蟑螂約有 75 種，尤其以德國蟑螂（Blattella germanica）及美洲蟑螂（Periplaneta americana）較為常見（徐爾烈，1990）。蟑螂為雜食性，舉凡人的食物、垃圾、皮革、紙、死昆蟲、痰液、外科敷料甚至糞便都可為其食物來源，因此可媒介多種細菌、病毒、黴菌及寄生蟲 (Pai, Chen & Peng, 2005; Pai, Ko & Chen, 2003b)，研究結果顯示醫院中所捕獲之美洲蟑螂曾有 33 種細菌、17 種黴菌檢出，而德國蟑螂曾有 23 種細菌、11 種黴菌 (Pai, Chen & Peng, 2004)及 6 種非結核分枝桿菌之檢出(Pai, Chen & Peng, 2003a)，已證實蟑螂可媒介多種細菌、病毒、黴菌及寄生蟲等病原，舉凡大腸桿菌(E. coli)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、弗勞地檸檬菌（Citrobacter freundii）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、. 5.

(17) 沙門氏菌屬（Salmonella spp.）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黏質沙雷氏菌（Serretia marcescens）、金黃葡萄球菌(Staphilococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphilococcus epidermidis）、產氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、念珠菌屬(Candida spp.)、酒麴菌屬(Rhizopus spp.)、麴菌屬（Aspergillus spp.）、毛黴菌屬(Mucor spp.)、痢疾阿米巴囊體（cysts of E. hystolitica）、隱孢子蟲卵囊(oocysts of C. parvum)、環孢子蟲(C. caytenesis)、貝氏同形孢子蟲(Isospora belli)、大腸纖毛蟲囊體(cysts of Balatidium)、蛔蟲卵(ova of Ascaris lumbricoides)、十二指腸鉤蟲（Anchylostoma deodunalae）、蟯蟲(Enterobius vermicularis)、鞭蟲卵(ova of Trichuris trichura)、糞小桿線蟲幼蟲(larva of Strogloides stercoralis)等，估計蟑螂可媒介攜帶之病原體應達百種以上 (Tatfeng et. al., 2005)。以德國蟑螂（Blattella germanica）而言，能媒介攜帶致病菌的研究頗多，以含菌量高低不等的飼料餵食後，其排泄物即可檢驗出含有足以致病的菌量長達約 114 日，證實德國蟑螂能媒介綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa ） (Fotedar, Banerjee & Shriniwas, 1993)；而對於德國蟑螂能媒介沙門氏菌屬（Salmonella spp.）的研究亦明確的發現：以固定的沙門氏菌菌量供其攝入其體內後將在 3-20 日內增殖約 105倍，並可隨其排泄物到處污染食物或飲水，進而導致極高的感染風險 (Klowden & Greenberg, 1976)；另外尚有以美洲蟑螂（Periplaneta americana）為對象的結果亦顯示：蟑螂可藉著攝入致病菌於體內增殖後，進而隨其糞便排泄出數萬倍菌量以上的致病菌，經由排泄物污染人類食物或飲水而危害人體健康 (Ash & Greenberg, 1980)。有研究針對在不同地方採集到的蟑螂進行綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等數種致病微生物的分析研究，藉以明瞭醫院環境相對於一般住宅區環境間的差異，結果發現醫院環境中誘捕的蟑螂高達 98.95％可分離出一種以上的致病菌，而住宅環. 6.

(18) 境中採集的蟑螂有 80.55％可分離出一種以上的致病菌，統計分析後顯示兩者間存在極為顯著的差異（p < 0.001）(Ash & Greenberg, 1980)，由此可推論類似醫院的環境原本就普遍存在較高密度的致病微生物，若再配合環境中高群棲密度的蟑螂分布，極可能因此造成院內感染風險升高。類似的研究模式以醫院為對象，分析在其環境中採集到的蟑螂體內外所帶的非結核性分枝桿菌，並應用分子生物學技術所得的研究結果，發現蟑螂亦具有媒介非結核性分枝桿菌的病媒潛能 (Fotedar et al., 1989)。由於分枝桿菌屬可造成人類感染症而漸漸為臨床所重視，近年來不論在臨床醫療或是公共衛生等領域已成為重要的課題。. 第二節. 非結核性分枝桿菌之流行病學意義. 1980 年以前非結核性分枝桿菌在臨床上尚未被充分的重視，非典型分枝桿菌（atypical Mycobacterium）、非結核性分枝桿菌（Mycobacterium other than tuberculosis, MOTT）、環境中的分枝桿菌（environmental Mycobacterium）等各種名稱都曾出現於各領域學術論文（沈光漢等，2001），最後非結核性分枝桿菌（ non-tuberculous Mycobacteria, NTM）此一名稱為各界所廣泛的接受 ( Falkinham＆J.O., 3rd., 1996)。分枝桿菌屬中，在人類歷史上曾造成極嚴重的疫病病原菌大致有二：一為痲瘋分枝桿菌（Mycobacteria leprae）會造成程度不一的痲瘋病症、另一為現今造成全世界致死率與盛行率最高的流行病－結核病（ tuberculosis ），其病原菌為結核分枝桿菌群（Mycobacteria tuberculosis complex）。近年來愛滋病的盛行率居高不下，導致臨床上後天免疫不全症候群（AIDS）合併非結核性分枝桿菌嚴重感染的病患劇增（沈光漢等，2001），在歐美等結核分枝桿菌盛行率非常低的地區國家中，非結核性分枝桿菌突出的盛行率與發生率是極為引人. 7.

(19) 注意的 (Griffith et al., 2007)。非結核性分枝桿菌廣泛的分布於生活週遭環境中，包含土壤及水－生水或處理過的水－皆可分離出非結核性分枝桿菌 ( Falkinham＆J.O., 3rd, 2002)，儘管直到目前為止，尚未有直接證據證明非結核性分枝桿菌是藉由人傳人或是動物傳人的傳播模式 (von Reyn et. al., 2002)，但是臨床上許多特定族群的非結核性分枝桿菌感染症案例，應與暴露於特定環境中有相當的關聯性 (von Reyn et. al., 2002)。非結核性分枝桿菌感染的發生不僅在衛生條件較落後的地區，依據公共衛生上的調查統計，現代化工業國家亦有著每十萬人 1.0 至 1.8 人不等的發生率 (Meissner & Anz, 1977)，依據美國疾病管制局（Centers for Disease Control and Prevension, U.S.）在 1981 至 1983 年針對非結核性分枝桿菌菌種分離鑑定的統計資料顯示：有 94％分離自肺部檢體、3％分離自皮膚或結締組織檢體、3％分離自淋巴節（O’Brien R.J ., et. al.,1987）；此外、美國公共衛生實驗室系統（Public Health Laboratory System, PHLS）於 1993 至 1996 年的實驗室統計分析資料亦顯示：有 75％的非結核性分枝桿菌分離自肺部痰液、10.3％分離自肺外肋膜液、7.3％分離自骨組織、5％分離自血液、2％分離自皮膚或結締組織、0.4％分離自淋巴結；同時在此四年期間非結核性分枝桿菌菌種在美國的盛行率前三名如下：Mycobacteria avium complex 為 2.9-3.6/100,000 人、 Mycobacteria fortuitum 為 0.46-0.6/100,000 人、Mycobacteria kansasii 為 0.2-0.31/100,000 人。分枝桿菌導致的臨床感染症而言，自 1997 年起美國公共衛生實驗室系統即發現非結核性分枝桿菌的分離檢出已較結核分枝桿菌普遍（Centers for Disease Control and Prevention, U.S.，1999）。雖然非結核性分枝桿菌被普遍認為是存在環境中常見的微生物，但醫學上已證實其中約有 50 種非結核性分枝桿菌，可能為臨床上導致人體感染症的病原菌( Falkinham. 8.

(20) ＆ J.O., 3rd, 2002)；自然界中非結核性分枝桿菌，亦可能感染許多動物，而使得這些被感染的動物形成佇主（reservoir），已知可由猪隻及家禽的淋巴結分離出 M. avium；由鳥類身上分離出 M. genavensae、M. fortuitum 及 M. avium；由魚類及蛙類分離出 M. chelonae (Falkinham ＆ J.O., 3rd,, 2002)。儘管人類接觸到環境中所分布的非結核性分枝桿菌機會相當頻繁，但由於其致病力相對較弱，因此造成臨床病徵的案例相對於其他病原體亦較少，其所引致的感染病徵亦隨著非結核性分支桿菌菌種不同，以及感染宿主的免疫系統反應能力而有所不同（D. Wagner ＆ L.S. Young，2004）。近廿年來合併感染人類免疫不全病毒(HIV)以及非結核性分枝桿菌的大量研究，亦說明了非結核性分枝桿菌在臨床上的重要性。由於非結核性分枝桿菌於流行病學的意義目前主要有兩點尚未釐清：第一、人們普遍的認知非結核性分枝桿菌，未直接被證實經由何種途徑與宿主接觸而傳染，嚴格來說未符合傳染病的定義，這也是美國至今仍未將其列為法定管制傳染病病原的最重要原因；第二、臨床診斷非結核性分枝桿菌感染症有相當的困難度，當實驗室分離出臨床檢體呈現非結核性分枝桿菌陽性時，其真實的狀況究竟為增殖（colonization）、感染（infection）或疾病（disease）的程度存有極大歧見 (Schluger, 2007)。台灣現已正式邁入老年化社會（中華民國內政部統計資訊服務網，2009），可預見的將來 65 歲以上老年族群的醫療保健，將成為公共衛生領域上最嚴峻的考驗之ㄧ，但人體隨著年齡增長而導致免疫機能衰退，實為必然的趨勢，加上台灣少子化的情勢使得安養中心及養護中心等老年人口密集群居的機構如雨後春筍的大量設立，安養及養護機構的環境衛生維護於是成為重要的課題之ㄧ，因為其住民通常伴隨著多重慢性疾患，且群居在機構內的環境增加了病原感染流行的機會（郭瑜欣，2008），臨床上已證實非結核性分枝桿菌感染且致病的對象主要為免疫機能不全或低下的特定族群. 9.

(21) （Griffith, et. al., 2007），又由於非結核性分支桿菌分布廣泛、所有人類生存的自然環境可說是無所不在，於是可能造成的非結核性分枝桿菌感染並致病的機會勢必在長期照護機構中相當普遍。. 第三節非結核性分枝桿菌之臨床意義依據細菌學的分類標準，分枝桿菌大致可分成兩大群：（1）結核分枝桿菌群（M. tuberculosis complex）以及（2）非結核性分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacteria）；而非結核性分枝桿菌可依據其正常生長速度大致區分為（1）七日內可形成完整菌落的「快速生長菌群」（rapid growers）、（2）七日以上才可形成完整菌落的「緩慢生長菌群」（slow growers）；又可依據其菌落的色素形成狀況區分為三大群：（1）其色素僅在光線照射下才形成的「光產色菌群」（photochromogens）、（2）其色素可在光線隔絕或照射下均可生成的「暗產色菌群」（scotochromogens）、（3）不論光照或隔絕光照均不產生色素的「非產色菌群」（nonphotochromogens）（結核菌檢驗手冊，2004）。非結核性分枝桿菌（ non-tuberculous Mycobacteria, NTM ）可在免疫妥協（immuno-compromised）或免疫機能健全（immuno-competent）的病患身上分離出來，臨床上可能導致無症狀或有症狀的感染，常見可分離出非結核性分枝桿菌的檢體類別為痰液、淋巴結、肋膜液、關節液、腹水、上皮或結締組織等 (Good, 1980)，並且隨著日趨成熟的分子生物學檢驗技術大量應用於輔助臨床診斷，具有意義的非結核性分枝桿菌感染症被診斷出來的比率也隨之越來越高（O’Brien R.J. et. al.,1987），曾有高雄市某公立傳染病專責醫院提出報告：2007 年該院診療疑似結核病感染的病患中，最後確認為結核分枝桿菌感染的病患人數佔了 61.08％（113/185）、非結核性分枝桿菌感染的病患人數佔了 38.92％（72/185），其中感染結核分枝桿菌的 11 例（11/113，9.73. 10.

(22) ％）可能同時合併感染非結核性分枝桿菌，其中感染非結核性分枝桿菌的人口約有 70 ％為 65 歲以上的老人，顯示臨床上感染結核分枝桿菌並且出現症狀的患者以老年人居多(p < 0.01)（薛榮海等，2009），而該醫院在 2008 年的統計數據中所有臨床檢體的分枝桿菌屬檢出菌種比例分別為：結核分枝桿菌（M. tuberculosis）佔 45％、M. abscessus 佔 12％、M. fortuitum 佔 12％、M. avium complex 佔 10％、M. kansasii 佔 9％、M. gordonae 佔 5％、M. scrofulaceum 佔 3％、M. chelonae 佔 2％、M. xenopi 佔 2％，非結核性分枝桿菌由臨床各種檢體分離出的比例更高達 55％，顯示台灣高雄地區非結核性分枝桿菌的盛行率可能已高於結核分枝桿菌。非結核性分枝桿菌感染症之臨床診斷可以下列三大原則：（1）胸部的放射影像或是高解析度的電腦影像分析（HCRT）、（2）至少採取患者三套以上痰液檢體進行抗酸性染色塗片檢驗、（3）需排除其他可能出現造成肺部的異常因素如：結核分枝桿菌感染；並且針對非結核性分枝桿菌的菌種鑑定建議技術應以分子生物學技術，取代傳統的細菌學生化鑑定技術 (Griffith, et. al., 2007)。由於近十年來分子生物學技術的突飛猛進，截至 2008 年為止、地球上的環境已經有超過 100 種的非結核性分枝桿菌被發現，並且可預期新發現的種類將會越來越多，但須強調並非所有非結核性分支桿菌皆為致病菌。目前於臨床上廣泛被認為可導致人體致病菌的非結核性分枝桿菌共有以下 31 種：M. avium、M. intracellulare、M. kansasii、M. paratuberculosis、 M. scrofulaceum 、 M. simiae 、 M. habana 、 M. interjectum 、 M. xenopi 、 M. heckeshornense、M. szulgai、M. fortuitum、M. immunogenum、M. chelonae、M. marinum、 M. genavense、M. haemophilum、M. celatum、M. conspicuum、M. malmoense、M. ulcerans、M. smegmatis、M. wolinskyi、M. goodii、M. thermoresistible、M. neoaurum、 M. vaccae、M. palustre、M. elephantis、M. bohemicam、M. septicum 等 (Katoch, 2004)。. 11.

(23) 12.

(24) 第三章材料與方法. 第一節. 研究對象與樣本採集. 目前台灣的合法安養及養護機構可約略區分為護理之家及安養中心兩大類，在地方上護理之家主管機關為衛生局、而安養中心主管機關為社會局，在本研究進行當下，高雄市政府衛生局合法立案之護理之家計有 30 家，社會局合法立案之安養中心計有 62 家，合計共 92 家為研究對象；前述機構經實地訪查並取得合作意願配合本研究期程之樣本計有護理之家 20 家（20/30，66.67％）、安養中心 49 家（49/62，79.03 ％），合計共 69 家（69/92，75.00％）。本研究之目的乃藉由採集前述樣本環境中所分布的蟑螂，分析其體內及體外存在的非結核性分枝桿菌，以明瞭高雄市安養及養護機構環境中經由病媒傳播非結核性分枝桿菌之風險程度，是故本研究並參酌昆蟲學上蟑螂密度監測之技術－利用雙層設計之捕蟑盒（每邊 15 公分長之八角型盒子，詳如圖 1），以魚骨粉及花生粉為誘餌，採捕蟑盒誘捕法（Reierson D.A., Rust M.K.，1997），每家護理之家或安養中心內外固定放置 10 個捕蟑盒，分別放置於住房、廢棄物集中處、廚房等，連續放置兩夜（王正雄，1997）後，將誘捕到之蟑螂先冰存 30 分鐘，使其停止活動，再依標準分類法加以分類計數（Harwood R.F. ＆ James M.T.，1979）。護理之家及安養中心蟑螂侵害率及密度之計算公式：(單位：隻/每個捕蟑盒) （白秀華等，1998）蟑螂密度＝每家蟑螂誘捕之總數 ÷ 每家擺置捕蟑盒之總數 × 100％。另外、針對前述配合本研究採集蟑螂之安養及養護機構徵求其住民採檢臨床檢體的意願，共計有 20 家（20/69，28.99％－護理之家 7 家、安養中心 13 家）、51 位住民願意配合進行之，針對外接人工呼吸器而進行氣管切開術的 12 位患者抽取其痰液. 13.

(25) 檢體、針對身體有明顯外傷（包含長期臥床所導致的缛瘡患者兩名）的 5 位患者採取其傷口無菌拭子檢體 5 件，並且採檢 33 位住民尿液檢體 33 件、1 位住民糞便檢體 1 件，共計 51 件臨床檢體同樣進行後續非結合性分枝桿菌的培養與分離，以便與環境中採集的蟑螂體內外檢體進行交叉比對其同源性（homogenous），目的在於發現並且評估環境中所分布的非結核性分枝桿菌是否可能經由蟑螂的媒介而造成住民感染的風險。. 第二節. 檢體萃取與培養. 一、蟑螂體表媒介微生物之檢查將上述收集到之蟑螂每隻裝入滅菌後之試管，在 0℃冰存 5 分鐘待其停止活動後，加入 2ml 之無菌生理食鹽水，搖動 2 分鐘，將上述蟑螂檢體分別取 0.1c.c，接種入 BACTEC MGIT 960（Becton Dikinson）液態培養基，置於 37％專用之培養系統中；確認液態培養系統培養非結核性分支桿菌陽性後，再轉殖於蛋基斜面培養基 Lowenstein- Jensen Slant（Becton Dikinson），培養於 37℃、二氧化碳濃度 5％之培養箱中（結核菌檢驗手冊，2004）。二、蟑螂體內媒介微生物之檢查體表經上述處理後之蟑螂，以 70﹪酒精浸泡 5 分鐘，在室溫下乾燥再以生理食鹽水浸泡 2-3 分鐘，去除酒精後，解剖蟑螂消化道，裝入無菌生理食鹽水研磨後離心，參照上述之方法，檢查蟑螂體內媒介之微生物。三、BACTEC MGIT 960 液態培養系統：對於分枝桿菌屬菌種的培養，液態培養基較之於固態培養基具有高敏感度、高污染率、培養時間短等特性，BACTEC MGIT 960 液態培養基其主要成份含 7ml. 14.

(26) 的 7H9、OADC養分及 PANTA抗生素、白蛋白(albumin)、六碳糖(dextrose)、過氧化氫酵素(catalase)、油酸(oleic acid)等，現為全世界用以培養分枝桿菌最普遍的液態培養基，培養結果條件為 37 ℃恆溫並且本系統定時每 60 分鐘測定培養基底部附著的螢光值變動，據此判讀培養基中是否以生成足夠的菌量，一般而言約長成 105~106CFU/ml菌量即顯示培養陽性。 BACTEC MGIT 960 液態培養系統的設計原是針對分枝桿菌屬，然而因為液態培養基高敏感性的特性使得雜菌污染的機會較之於固態培養基嚴重許多，雖然已在當中加入 PANTA 廣效性抗生素以抑制其他菌種，仍免不了當 BACTEC MGIT 960 顯示陽性時，為確認當中的培養產物為分枝桿菌而再以抗酸性染色鏡檢判讀之。 BACTEC MGIT 960 專用液態培養系統專用「Mycobacteria Growth Indicator Tube」7 毫升內容物： 1. 螢光指示劑：Tris 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline ruthenium chloride pentahydrate 2. 配方調整後 7H9 培養液：5.9 g/L 濃度的 7H9 膠粉 3. 牛血清白蛋白（bovine albumin）：50.0 g/L 4. 六碳糖(dextrose)：20.0 g/L 5. 多氧聚合乙烯硬酯(polyoxyethylene stesrate)：1.1 g/L 6. 過氧化氫酵素(catalase)：0.03 g/L 7. 油酸(oleic acid)：0.1 g/L 8. Polymyxin B：320 U/tube，主要抗菌對象為革蘭氏陰性菌 9. Amophotericin B：32 μg/tube，主要抗菌對象為黴菌. 15.

(27) 10. Nalidixic acid：128 μg/tube，主要抗菌對象含革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌，藉由干擾 DNA 聚合作用抑制細菌 DNA 合成。 11. Trimethoprim：32 μg/tube，為廣效性抗生素。 12. Azlocillin：32 μg/tube，為廣效性抗生素。當接種檢體完成後，將液態培養基置入 BACTEC MGIT 960 液態培養系統，系統設定為恆溫 37％，即可依前述偵測原理判定培養結果是否呈現陽性，在系統顯示陽性時即可取出液態培養基，以 3,000×g 離心 15 分鐘，倒除上清液後並以無菌滴管吸取少許沉渣進行塗片靜置風乾後，翌日即可進行抗酸菌染色並鏡檢，目的在於檢視確認培養產物是否為分枝桿菌類菌種。四、俟確認液態培養基培養分枝桿菌陽性後，轉殖於蛋基培養基斜面（Lowenstein-Jensen）（結核菌檢驗手冊，2004），並於 37℃、5％CO2 的專用培養箱中，待其形成完整菌落後即可進行 DNA 萃取工作。. 第三節. 培養產物抗酸菌染色及鏡檢判讀. 一、抗酸性染色(acid-fast stain) 鏡檢分枝桿菌的染色技術大致上有三種，「 Ziehl-Neelsen 染色」（又名「carbolfuchsin 染色」或「熱染法」）、「Kinyoun 染色法」以及「螢光抗酸菌染色法」，本研究採以國際抗癆聯盟專家較推薦的「Ziehl- Neelsen 染色法」（結核菌檢驗手冊， 2004）。「Ziehl-Neelsen 染色」試劑套組（BD Stain Kits and Reagents）含二種染色劑以及酸性酒精，分別為：A 劑－carbolfuchsin 染劑(0.3 g fuchsin 溶於 10 mL 95％ ethanol，再加入 5 mL phenol、95 mL ddH2O)；B劑－酸性酒精(3 mL的HCl加入 95％. 16.

(28) 乙醇)；C劑－methylene blue染劑（0.3 g methylene blue於 100 mL ddH2O）。染色步驟如下：（一）抹片染色前需於 80℃烤箱中加熱 15 分鐘。（二）覆蓋 carbofuchsin 染劑（A 劑）於抹片上。（三）使用酒精燈加熱已覆蓋 carbofuchsin 染劑的抹片，直至抹面上冒出少許蒸氣，切忌烤至沸騰或使之蒸乾。（四）靜置 5 分鐘。（五）酸性酒精（B 劑）脫色。清水沖洗之，瀝乾。（六）覆蓋 methylene blue（C 劑）作為背景色，靜置 1 分鐘。（七）清水沖洗之，晾乾後以 100×油鏡鏡檢判讀之。二、抗酸菌鏡檢判讀經過 Ziehl-Neelsen 染色的塗片，若待檢檢體中含有分枝桿菌，其細胞壁中的 mycolic acid 及 waxes 將與 Carbofuchsin 形成穩定的複合物，即使以酸性酒精亦不容易脫色；100×油鏡下經 Ziehl-Neelsen 染色的分枝桿菌一般為桿狀， 1-10μm 長、0.2-0.6μm 寬，但有時會呈現球狀或絲狀（長、細長或分枝），菌體通常略呈彎曲狀，並約略可見相對濃染的帶狀區，培養後的分枝桿菌由於菌量高，所以部份菌種會相互糾結成「索狀」(cord formation)、「半索狀」（pseudo-cord formation）等特殊形態。已知部分非屬於分枝桿菌屬菌種亦可能經 Ziehl-Neelsen 染色呈現陽性，如：Nocardia、 Corynebacterium 等，此為可能造成誤判而導致分枝桿菌偽陽性的最大因素。本研究中當培養產物經抗酸菌染色並鏡檢確認為陽性（即確認為分枝桿菌）後，隨即將該檢體培養產物轉殖於固態培養基，俟其長成完整菌落後，. 17.

(29) 採集 2~4 個菌落以進行後續聚合酶連鎖反應－限制酵素片段長度多型性 (Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism analysis)鑑別菌種。. 第四節. 以聚合酶連鎖反應（PCR）增幅標的核酸片段. 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)是一種以核酸生物化學為基礎的分子生物學技術，應用於菌種鑑定發展迄今約廿年時間，利用此技術可由極少的菌量中分離出分枝桿菌的核酸，再以特定的核酸片段做為連鎖反應的引子(primer)，於特定溫度條件設定下在微量試管中反覆進行變性(denature)、鍛化(annealing)、延伸 (extention)循環，每次循環即可將原檢體中萃取出的標的核酸片段數量增幅 2 倍，如此連續循環增幅 35 次即可增幅標的核酸片段 235倍。一、核酸萃取(DNA extraction) 以 NucleoSpin Tissue 套組(Macherey-Nagel)及建議之分枝桿菌核酸萃取步驟操作，套組中含有 T1 溶解緩衝液(Lysis buffer T1)、B1 緩衝液（Buffer B1）、 B2 緩衝液（Buffer B2）、B5 清洗緩衝液(Wash Buffer B5)、BW 清洗緩衝液 (Wash Buffer BW)、BE 溶離緩衝液(Elution Buffer BE)、K 蛋白酶(Proteinase K)、PB 蛋白酶緩衝液（Proteinase Buffer PB）、B3 溶解緩衝液(Lysis buffer B3) 等商業配方。 MGIT 陽性並且抗酸性染色陽性轉殖於蛋基培養基斜面之長成菌落 2~4 個，以二次純水清洗 2 次，3,000×g 離心 15 分鐘後倒除上清液並吸取其沉渣約 100 μl；加入 180 μl B1 緩衝液（Buffer B1）及 25 μl K 蛋白酶(Proteinase K) 後強力震盪混合均勻，置於 56℃恆溫乾浴槽直到翌日(overnight)；取出檢體. 18.

(30) 試管加入 B3 溶解緩衝液(Lysis buffer B3)200 μl 並強力震盪後置於 70℃恆溫乾浴槽 10 分鐘；取出檢體試管再加入 210 μl 純酒精(100％) 並強力震盪；最後將檢體滴入於套組所附之特殊試管中，以冷凍離心機 11,000×g 超高速離心 1 分鐘即完成分枝桿菌核酸萃取程序。二、聚合酶連鎖反應（PCR） (一)引子(primer) 本研究所採用針對分枝桿菌屬高度專一性的引子(primer) TB11 (5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’) 與 TB12（5’-CTTGTCGAACCGC ATACCCT-3’），前述引子購自 IDT 生物科技公司（Integrated DNA Technologies corp.USA）(Pai. et al., 2003a)。 (二)變性(denature)、鍛化(annealing)、延伸(extention)循環參酌相關文獻關於 PCR 循環的條件設定，應用 TB11 及 TB12 兩種引子Taq聚合酶、dNTP （2X ReddyMix TM PCR Master Mix購自 Thermo Scientific, ABgene corp. UK）作為反應基質條件針對分枝桿菌屬專一基因組(genome)－hsp65 的反應溫度及時間，大致上有兩種設定： 1、35 個增幅循環 94℃15 秒鐘的變性反應(denature)、55℃30 秒鐘的鍛化反應(annealing)、72℃60 秒鐘的延伸反應(extention) (Pai et al., 2003a)。 2、45 個增幅循環 94℃1 分鐘的變性反應(denature)、60℃1 分鐘的鍛化反應(annealing)、72℃1 分鐘的延伸反應(extention)。聚合酶連鎖反應的特性增幅循環越多次，理論上當然越容易將極. 19.

(31) 微量的標的核酸序列增幅放大為有意義且可偵測的訊號，但同時也將可能使得原本無意義的雜訊變的有意義而造成偽陽性，因此本研究採用第一種增幅條件設定，因為其增幅循環 35 次較之於第二種條件增幅循環 45 次較不易出現偽陽性。本研究採用之聚合酶連鎖反應溫度循環機為 Mastercycler gradient Authorized Thermal Cycler（eppendorf corp. USA）。（三）經前述條件進行聚合酶連鎖反應後的產物以 3％電泳膠電泳分析該檢體是否含有非結核性分枝桿菌屬核酸，乃依據在紫外光下電泳膠片上 435bp 位置是否存在訊號而定，若出現 435bp 位置的訊號則代表該檢體含有非結核性分枝桿菌屬菌種，反之則無。電泳膠的處理分析所需之材料如下： 1. 電泳膠粉(Agarose gel powder，購自 Thermo Scientific, ABgene corp. UK) 2.迷你水平電泳槽（Mini Gel System MJ-105, BioProducts Corp. Taiwan） 3.核酸染劑(Ethidium Bromide) 4.紫外燈箱(附相機)（SCOPEWD, TOPBIO Corp. Taiwan） 5.電泳標示標準液(Marker Bio-100 Mass DNA Ladder，購自台灣波仕特生物科技公司) 6.緩衝液 10X TB buffer（自行配製）： Tris 18.2 g 溶於 60 ml 二次水. 20.

(32) 以 HCl 調 pH 至 6.8 加水至 100 ml （四）每個樣本需進行 PCR 之各項試劑配方及用量： PCR Master mix.25 μl、核酸萃取液 3 μl、TB11 及 TB12 引子各 1 μl、二次純水 20μl，加入 0.2 毫升微量反應試管後充分混合即可置入 Mastercycler gradient Authorized Thermal Cycler（Eppendorf corp. USA）依設定之條件進行 PCR 反應。. 第五節. 以限制酶片段長度多型性（RFLP）分析非結核性分枝桿菌之菌種. 根據已發表之學術論文應用 PCR-RFLP 進行非結核性分枝桿菌菌種的限制酶種類，本研究採用 BstEⅡ及 HaeⅢ兩種限制酶切分經聚合酶連鎖反應（PCR）增幅標的 hsp65 核酸片段，取 PCR 產物中加入 BstEⅡ置於 60℃水浴槽 60 分鐘，同時亦取 PCR 產物加入 HaeⅢ置於 37℃水浴槽 60 分鐘 ( Taylor, et. al.,1997 ;Pai et al., 2003a)，即可接著進行 3％電泳膠片的電泳分析作業（材料需求同第四節）。本研究所採用的 BstEⅡ及 HaeⅢ兩種限制酶購自 NEW ENGLAND BioLabs Inc.， BstEⅡ生產序號為 R0162S－0840810；HaeⅢ生產序號為 R0108S－0320811，其作用針對核酸基座序列為 HaeIII（R0108S）5’…GGCC…3’. 3’…CCGG…5＇； BstE II. （R0162S）5’…GGTNACC…3’ 3’…CCANTGG…5’。參酌原廠說明書並自行試驗結果，於進行限制酶切分實驗之各樣試劑量為：PCR 產物 10 μl、限制酶 1 μl、10×PBS 緩衝液 3 μl、二次純水 16 μl。完成電泳後的電泳膠片即可依據在紫外光下電泳膠片上出現的標示記號對照表 7. 21.

(33) 進行非結核性分枝桿菌的菌種鑑定工作 (Taylor, et. al., 1997)。. 第六節. 比對檢體採集處所以及非結核性分枝桿菌菌種分離成果. 經 PCR-RFLP 分析確認為非結核性分枝桿菌再比對檢體編號及採集來源，針對 69 家長期照護機構分別進行分析，以單一機構分離出非結核性分枝桿菌之檢體陽性率作為統計依據，以研判其環境中非結核性分枝桿菌之分布狀況。. 22.

(34) 第四章結. 果. 第一節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分布之狀況高雄市政府衛生局及社會局合法立案之護理之家計有 30 家、安養中心計有 62 家，合計共 92 家；經實地訪查並取得合作意願配合本研究期程之樣本計有護理之家 20 家（20/30，66.67％）、安養中心 49 家（49/62，79.03％），合計共 69 家（69/92， 75.00％），在其環境中共放置 550 個蟑螂屋，分別在安養中心捕獲德國蟑螂（Blattella germanica）351 隻、美洲蟑螂（Periplaneta americana）89 隻；在護理之家捕獲德國蟑螂 88 隻、美洲蟑螂 30 隻，總計捕獲 558 隻蟑螂，於 20 家護理之家中計有 16 家（16/20，80.00％）捕獲蟑螂，於 49 家安養中心計有 29 家（29/49，59.18％）捕獲蟑螂，平均蟑螂之侵害率為 65.2%(45/69)，蟑螂之密度為 1.01 隻/每個捕蟑盒。所捕獲的蟑螂種類美洲蟑螂（Periplaneta americana）數量為 119 隻，分別來自室內 63 隻（63/119，52.94％）、室外 56 隻（56/119，47.06％）；德國蟑螂（Blattella germanica）數量為 439 隻，分別來自室內 427（427/439，97.27％）隻、室外 12 隻（12/439，2.73 ％），以捕獲的數量而言，室內的德國蟑螂數量即佔了總數量的七成以上；而於安養中心室外捕獲的美洲蟑螂數量為 42 隻（42/89，47.19％）、室內捕獲的數量為 47 隻（47/89，52.81％），室外捕獲的德國蟑螂數量為 10 隻（10/351，2.86％），室內捕獲的數量為 341 隻（341/351，97.15％）；於護理之家室外捕獲的美洲蟑螂數量為 2 隻（2/30，6.67％）、室內捕獲的數量為 28 隻（28/30，93.33％），室外捕獲的德國蟑螂數量為 0 隻（0/88，0％）、室內捕獲的數量為 88 隻（88/88，100％），由此可獲得一結論：在本研究執行採樣期間（2008 年 9 月至 11 月間），德國蟑螂是為分布於高雄市安養及養護機構室內主要的蟑螂品種。. 23.

(35) 本研究中所捕獲的蟑螂數量雖達 558 隻，然而、因為需解剖蟑螂體腔並以無菌生理食鹽水萃取其檢體，故將齡期或體型過小者排除於本研究適用樣本之外，最後總計適於本研究可萃取蟑螂體內外檢體標準者共 258 隻－包含採集自護理之家的蟑螂數量為 80 隻，以及採集自安養中心的蟑螂數量為 178 隻；前述 258 隻蟑螂檢體均分別萃取其體內外檢體各一，接續進行分枝桿菌培養工作。. 第二節高雄市安養及養護機構環境中蟑螂非結核性分枝桿菌之分離所捕獲的蟑螂排除其因體型過小不易解剖之因素，於採集之 558 隻蟑螂中選取 258 隻蟑螂（德國蟑螂共計 171 隻、美洲蟑螂共計 87 隻）－分別為採集自安養中心的德國蟑螂計 117 隻、採集自安養中心的美洲蟑螂計 63 隻、採集自護理之家的德國蟑螂計 54 隻、採集自護理之家的美洲蟑螂計 24 隻，進行體內外檢體萃取共計 516 個，而後以 BATEC MGIT 960 液態培養系統培養之，培養陽性結果計有 148 個檢體，（148/516，28.68％），再以 Ziehl-Neelsen 染色法確認共計有 37 個（37/516，7.17％）檢體呈現抗酸性染色陽性，轉殖於固態培養基 L-J slant－培養自蟑螂體外共 24 個檢體（24/37，64.86％)、體內共 13 個檢體（13/37，35.14％），分別來自於安養中心編號第 2、5、12、13、14、27、31、37、42、56、58、59，護理之家編號第 H7、H22、 H29，以上共計 15 家（詳見表 5、表 6）分離出的非結核性分枝桿菌有 7 種（詳見圖 2、圖 3），分別為：未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）13 株（13/37， 35.14％）、M. trivale 計 7 株（7/37，18.92％）、M. szulgai 計 6 株（6/37，16.22％）、 M. abscessus 計 4 株（4/37，10.81%）、M. gordonae IV 計 3 株（3/37，8.11％）、M. nonchromogencum II 計 3 株（3/37，8.11％）、M. flavescens I 計 1 株（1/37，2.70%）。. 24.

(36) 再深入分析前述由蟑螂品種與體內外分離出之非結核性分枝桿菌，可發現以最初 258 隻進行體內外檢體萃取的蟑螂種類原本德國蟑螂與美洲蟑螂的數量比例約為 2 比 1（171：87），但經培養後進行非結核性分枝桿菌分離的結果發現呈現陽性的蟑螂種類數量比例約為 1 比 1（德國蟑螂 19 隻、美洲蟑螂 18 隻），由此可知分布在高雄市安養及養護機構中的美洲蟑螂體內外可能帶有的非結核性分枝桿菌機率，可能較之於德國蟑螂高，亦即以非結核分枝桿菌而言、美洲蟑螂具有較高之病媒潛力（詳見圖 4）。在本研究中由美洲蟑螂體內外分離出的非結核性分枝桿菌菌種以未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）6 株（6/18，33.33％）最多、其次為 M. trivale 計 5 株（5/18，27.78％）、M. szulgai 計 3 株（3/18，16.67％）、M. abscessus 計 2 株（2/18， 11.11%）、M. gordonae II 計 1 株（1/18，5.56％）、M. nonchromogencum II 計 1 株（1/18， 5.56％）；而由德國蟑螂體內外分離出的非結核性分枝桿菌菌種以未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）7 株（7/19，36.84％）最多、其次為 M. szulgai 計 3 株（3/19，15.79％）、M. trivale 計 2 株（2/19，10.53％）、M. abscessus 計 2 株（2/19， 10.53%）、M. gordonae II 計 2 株（2/19，10.53％）、M. nonchromogencum II 計 2 株（2/19， 10.53％）、M. flavescens I 計 1 株（1/19，5.26％）。由前述各項數據顯示，不論德國蟑螂或是美洲蟑螂體內外所帶的非結核性分枝桿菌均以未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）最多，但美洲蟑螂體內外分離出 M. trivale 的機會明顯較之於德國蟑螂普遍（p<0.05），此外、M. flavescens I 僅於德國蟑螂體外分離出一株亦為其間明顯的差異（p<0.01）（詳見表 3、圖 7）。細究非結核性分枝桿菌分離自高雄市安養及養護機構分佈之蟑螂體內外狀況（詳見表 4、圖 5），發現分離自蟑螂體外的非結核性分枝桿菌共計 24 株（24/37，64.86 ％），其菌種分析結果為：未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）7 株（7/24，. 25.

(37) 29.17％）、M. szulgai 計 5 株（5/24，20.83％）、M. trivale 計 5 株（5/24，20.83％）、 M. abscessus 計 4 株（4/24，16.67%）、M. nonchromogencum II 計 2 株（2/24，8.34%）、 M. flavescens I 計 1 株（1/24，4.17%）；而分離自蟑螂體內的非結核性分枝桿菌共計 13 株（13/37，35.14％），其菌種分析結果為：未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）6 株（6/13，46.15％）、M. trivale 計 2 株（2/13，15.38％）、M. nonchromogencum II 計 2 株（2/13，15.38％）、M. gordonae II 計 2 株（2/13，15.38％）、M. szulgai 計 1 株（1/13，7.70％）。綜上所述，M. abscessus、M. flavescens I 僅見由蟑螂體外培養分離出，M. gordonae II 僅見由蟑螂體內培養分離出，並且 M. szulgai 於蟑螂體內及體外雖然都可培養分出，但比例上有顯著差異（體外：體內＝20.83％：7.70％）。. 第三節高雄市安養及養護機構環境中分佈蟑螂且潛在非結核性分枝桿菌感染其住民之風險評估本研究進行期間並且同時採取高雄市安養及養護機構中有配合意願之住民臨床檢體（含痰液檢體 12 件、尿液檢體 33 件、傷口或缛瘡檢體 5 件、糞便檢體 1 件）共計 51 件進行分枝桿菌培養及分離，前述 51 件檢體分布於 20 家安養及養護機構（20 /69，28.99％：護理之家 7 家、安養中心 13 家）之中，經過分枝桿菌的培養與分離後有 1 個檢體檢出 M. nonchromogencum II，為編號 47 號住民傷口之臨床檢體、居住於編號第 18 號安養中心之中，惟雖於該安養中心環境中採集到 10 隻美洲蟑螂，但均未能於蟑螂體內外檢體中培養分離出任何非結核性分枝桿菌，因而未能直接進行菌株同源性比對。. 26.

(38) 第五章討. 第一節. 論. 高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分布之狀況. 依據第四章第一節本研究監測高雄市合法立案之安養及養護機構環境中所分布的蟑螂發現：在 49 個（49/62，79.03％）安養中心樣本中，捕獲蟑螂的家數為 29 家，陽性率為 59.18％（29/49）；在 20 個（20/30，66.67％）護理之家樣本中，捕獲蟑螂的家數為 16 家，陽性率為 80.00％（16/20）；一般而言、護理之家的環境衛生條件給人們的印象較之於安養中心為佳，因其住民需要較健全的專業醫療照護，故多附設於醫院之內(陳晶瑩，2003)，並且衛生主管機關參酌相關規範修定了「護理機構分類設置標準」（民國 97 年 09 月 23 日修定），相對於社會福利主管機關依據「老人福利機構設置標準」（民國 96 年 07 月 30 日修定）相關條文，以環境衛生標準而言，顯然護理之家的管理規範較為嚴格（中華民國全國法規資料庫，2010），因而客觀條件上護理之家的衛環境生條件亦應較佳，然而參酌前述捕獲蟑螂的安養及養護機構陽性率，事實卻大相逕庭，反而護理之家的樣本捕獲蟑螂之陽性率較安養中心為高（80.00％： 59.18％），並且呈現顯著差異（p<0.05），爰此、或可推論：高雄市整體環境的蟑螂群棲密度原就達到相當的程度，因此不論一般住家、安養中心或是護理之家均已是長期處於蟑螂侵擾的威脅之下，而且本研究結果計算得出高雄市安養及養護機構平均蟑螂侵害率為 65.2％（45/69），估計一般住家的蟑螂侵害率應為更高，所以地處熱帶地區的高雄市民眾無可避免的必須面對此極為棘手之蟑螂侵擾生活環境的問題。. 27.

(39) 第二節. 高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分離之非結核性分枝桿菌種類及分佈. 本研究針對高雄市安養及養護機構中所捕獲分布其間的蟑螂，萃取其體內外的檢體進行非結核性分枝桿菌的培養與分離檢驗工作，以安養中心對照護理之家的非結核性分枝桿菌分離結果而言，兩者皆以未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）比例最高－護理之家佔了 44.44％（4/9）、安養中心佔了 32.14％（9/28），其餘於護理之家中分離出的非結核性分枝桿菌種類及數量分別是 M. trivale 1 株（1/9， 11.11％）、M. nonchromogencum II 1 株（1/9，11.11％）、M. flavescens I 1 株（1/9，11.11 ％）、M. szulgai 1 株（1/9，11.11％）；另外、在高雄市安養中心環境中分離出的非結核性分枝桿菌菌種及數量分別為 M. trivale 6 株（6/28，21.43％）、M. szulgai 5 株（5/28， 17.56％）、M. abscessus 4 株（4/28，14.29％）、M. gordonae IV 2 株（2/28，7.14％）、 M. nonchromogencum II 2 株（2/28，7.14％），基於前述分析結果（詳見表 1、圖 6），除了 M. abscessus 以及 M. gordonae IV 未曾於護理之家環境中發現、M. flavescens I 未曾於安養機構環境中發現之外，據研判可能與樣本數差異過於懸殊有關，在本研究取得的原始樣本數在護理之家與安養中心比例上約為 1/4（118/440），極可能在護理之家取得類似於安養中心樣本規模大小後，再進行同樣的分析或許可以獲致進一步的結論。然而在以本研究成果比對曾發表之學術論文，探討有關醫院環境中採集之美洲蟑螂，分離其體內外之非結核性分支桿菌可發現其間存在明顯的差異(Pai et al., 2003a)，除了 M. gordonae 為醫院環境與養護及安養機構環境中皆可能存在的非結核性分枝桿菌外， M. kansaisii、M. xenopi、M. hemophilium、M. fortuitum、M. avium 僅在醫院環境中誘捕之蟑螂身上分離出來，而未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified. 28.

(40) NTM）、M. trivale、M. szulgai、M. abscessus 計 4 株、M. nonchromogencum II、 M. flavescens I 僅於養護及安養機構環境中存在，顯示醫院環境與養護及安養機構環境中可能分佈的非結核性分枝桿菌菌種明顯不同；臨床上 M. kansaisii、M. xenopi、M. hemophilium、M. fortuitum、M. avium，常造成患者明顯的症狀，為高致病力且治療不易的致病菌（ Falkinham ＆ J.O., 3rd, 2002；Griffith, et. al., 2007），推論醫院環境與養護及安養機構環境中分佈的非結核性分枝桿菌菌種，或因其收治的對象不同而呈現顯著差異。有研究指出 2008 年台灣南部某公立傳染病專責醫院臨床檢體分離出 8 種非結核性分枝桿菌：M. abscessus、M. fortuitum、M. avium complex、M. kansasi、M. gordonae、 M. scrofulaceum、M. chelonae、M. xenopi，對照前述研究結果針對醫院環境中採集之美洲蟑螂，可分離出 6 種非結核性分支桿菌菌種(Pai et al., 2003a)：M. kansaisii、M. xenopi、M. gordonae、M. hemophilium、M. fortuitum、M. avium，可發現除了 M. hemophilium 外，兩者分離培養出之菌種大致相似，且為致病力較為顯著的菌種。. 第三節. 高雄市安養及養護機構環境中蟑螂體內外分離之非結核性分枝桿菌種類與蟑螂品種. 依據第四章第二節並綜合本研究所捕獲的高雄市安養及養護機構環境中分布的蟑螂以及由其體內外培養分離出的非結核性分枝桿菌分析，可知美洲蟑螂可能成為環境中媒介非結核性分枝桿菌的機率明顯較德國蟑螂為高，並且兩者間體內外所攜帶的非結核性分枝桿菌菌種除了 M. flavescens I 及之外，無顯著差異。又針對不論是美洲蟑螂或德國蟑螂體內外所分離出的非結核性分枝桿菌菌種及數量進行分析，可獲致結論如下：分離自蟑螂體內的未能分類的非結核性分枝桿菌. 29.

(41) （unidentified NTM）比例（46.15％），明顯比分離自蟑螂體外的未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）比例（29.17％）為高（p<0.05），並且分離自蟑螂體外的 M. szulgai 比例（20.83％）亦明顯較分離自蟑螂體內的比例（7.69％）為高（p<0.05），此外、M. abscessus 以及 M. flavescens I 兩種非結核性分枝桿菌均僅經由萃取自蟑螂體外之檢體分離而得的，前述兩種非結核性分枝桿菌未能於萃取自蟑螂體內之檢體檢出。. 第四節高雄市安養及養護機構環境中分布蟑螂且潛在非結核性分枝桿菌感染其住民之風險評估參酌本研究第四章第三節針對高雄市安養及養護機構中取得的住民臨床檢體非結核性分枝桿菌培養及分離結果分析，或可獲致進一步的推論：因高雄市安養及養護機構機構中不論分布其中的美洲蟑螂或是德國蟑螂體內外均可能會媒介 M. nonchromogencum II，雖然本研究培養分離出的 3 株 M. nonchromogencum II 均可能是原本就分布於安養中心或其週邊環境，但無可諱言的合理推論：透過此一傳染途徑極可能在缺乏自主行動能力的住民身上傳播非結核性分枝桿菌而令其致病。然而 M. nonchromogencum II 包含 M. avium complex 、 M. malmoense 、 M. shimoidei…常為臨床上有意義的致病菌，依據 2007 年美國胸腔醫學會及感染醫學會聯合發表之「非結核性分枝桿菌之診斷、治療與預防標準工作指引」（譯），大部分的 M. nonchronogencum II 不常於上皮組織培養分離出來，臨床上一但確認其為主要的致病菌，通常需要依循每日服用適當的抗生素（如：clarithromycin、rifampin…等）療程持續 12 至 18 個月才有治癒的可能。因此、對於前述住民傷口之臨床狀況應尤其留意是否出現癒合困難的問題，甚至應建議應及早投以特定的抗生素以抑止 M.. 30.

(42) nonchromogencum II 危害該患者生命。本研究結果顯示：於高雄市 93 家安養及養護機構中，經標準化調查確有蟑螂發生其環境的有 69 家，陽性比率高達 74.19％；又 69 家發生蟑螂侵擾的安養及養護機構中，確實由蟑螂體內外培養分離出非結核性分枝桿菌的家數為 15 家，陽性比率為 21.74％，而前述 15 家環境中分布有非結核性分枝桿菌的安養及養護機構中，有 5 家非結核性分枝桿菌陽性率高達 20％以上，對其住民而言、長年生活於如此的環境之中其生命品質與健康情形實為堪虞。. 31.

(43) 第六章結. 論. 一、高雄市安養及養護機構環境中蟑螂分布之狀況，護理之家捕獲蟑螂之陽性率 80.00％明顯高於安養中心 59.18％。二、本研究執行採樣期間（2008 年 9 月至 11 月間），德國蟑螂是為分布於高雄市安養及養護機構室內最主要的蟑螂品種。三、美洲蟑螂體內外分離出 M. trivale 的比例明顯較之於德國蟑螂多；M. flavescens I 僅於德國蟑螂體外分離出一株。四、高雄市安養及養護機構環境中分布的蟑螂，以及由其體內外培養分離出的非結核性分枝桿菌分析，美洲蟑螂與德國蟑螂非結核性分枝桿菌檢出數比樣本數為 0.207（18/87）：0.111（19/171），顯示美洲蟑螂可能媒介非結核性分枝桿菌的潛力較高。五、不論是美洲蟑螂或德國蟑螂，分離自蟑螂體內的未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）比例（46.15％），明顯比分離自蟑螂體外的未能分類的非結核性分枝桿菌（unidentified NTM）比例（29.17％）為高。六、不論是美洲蟑螂或德國蟑螂，分離自蟑螂體外的 M. szulgai 比例（20.83％）亦明顯較分離自蟑螂體內的比例（7.69％）為高。七、不論是美洲蟑螂或德國蟑螂，M. abscessus 以及 M. flavescens I 兩種非結核性分枝桿菌均自蟑螂體外分離檢出，而其未能於蟑螂體內檢出。八、高雄市安養及養護機構中的美洲蟑螂或是德國蟑螂體內外均分離出 M. nonchromogencum II，並且有住民傷口亦檢出有 M. nonchromogencum II 存在，因而不能排除 M. nonchromogencum II 可藉由環境中分佈的蟑螂媒介至住民身上的可能性。. 32.