使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁

此實驗選擇使用「無血清培養基 + 3% DMSO」作為冷凍保存液，

將牙髓間葉幹細胞分別經過無磁性和磁性冷凍法進行細胞冷凍保存，

經 過 冷 凍保 存一週 後 ， 將細 胞解凍 ， 立 即利 用流式 細 胞 儀進 行 apoptosis assay，分析解凍後細胞存活率，結果發現，無磁性冷凍組 其平均細胞存活率為 (57.4 ± 1.5)%，磁性冷凍組平均細胞存活率為 (76.2 ± 4.8)%，而未冷凍控制組平均細胞存活率為 (84.9 ± 2.7) %。經 過one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，未冷 凍控制組平均細胞存活率顯著高於無磁性冷凍組和磁性冷凍組 (p <

0.05)，而磁性冷凍組平均細胞存活率顯著高於無磁性冷凍組 (p <

0.05) (圖 7)。

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第五節 細胞冷凍解凍後之貼附率分析

此實驗為觀察細胞經不同冷凍方法冷凍解凍後的貼附能力。牙髓 間葉幹細胞經過冷凍解凍後將細胞種在細胞培養盤上，經過六個小時，

用DPBS 沖洗掉未貼附的細胞，之後利用 MTT assay 觀察吸光值。將 未冷凍的牙髓間葉幹細胞貼附後的 MTT assay 吸光值當做 1，經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，牙髓幹 細胞經磁性冷凍解凍後的平均貼附率 ((53.3 ± 7.6)%) 顯著高於無磁 性冷凍組的平均貼附率 ((39.4 ± 1.1)%) (p < 0.05) (如圖 8 所示)。

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第六節 細胞冷凍解凍後之複製率分析

此實驗利用BrdU assay 觀察比較牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方法 冷凍解凍後的複製率，分別藉由免疫細胞染色觀察和流式細胞儀量化 檢測。免疫細胞染色結果顯示，不論是未冷凍組、無磁性冷凍組和磁 性冷凍組在顯微鏡下面皆可以觀察到有細胞的細胞核呈現深褐色，這 代表此細胞有被Biotinylated monoclonal anti-BrdU 抗體所染到，也就 是此細胞為新生成的細胞，而未被抗體所染到的細胞，其細胞核因被 hemotoxylin 染色而呈現淡藍色 (圖 9)。另一方面，使用 PE Mouse Anti-BrdU 抗體進行細胞免疫染色，再經由流式細胞儀進行量化分析，

結果發現被染到抗體的細胞佔所有細胞的比例，其平均值未冷凍組為 (73.4 ± 0.9)%，無磁性冷凍組為 (41.9 ± 5.4)%，磁性冷凍組為 (74.1 ± 4.7)%。經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發 現，無磁性冷凍組的平均複製率顯著低於未冷凍組和磁性冷凍組 (p <

0.05)，而磁性冷凍組與未冷凍組之間的複製率沒有顯著性差異 (圖 10)。

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第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析

本實驗利用流式細胞儀分析比較牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方法 冷凍解凍後的表面標誌表現量。本實驗所檢測的間葉幹細胞負向標誌 (Negative marker) 包括 CD14 和 CD34，而正向標誌 (Positive marker) 包括 CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD166 和 STRO-1。牙 髓間葉幹細胞利用流式細胞儀進行表面標誌的分析 (圖 11-13)，各個 標誌在不同組別的表現量結果如列表所示 (表 1)，各組之間表現量的 比較則使用one-way ANOVA 和 Scheffe法 (Post Hoc檢定) 進行檢定。

其中結果發現負向標誌CD14 和 CD34 不論在未冷凍組、無磁性冷凍 組和磁性冷凍組平均表現量都低於 1%，而且三組平均表現量沒有顯 著性差異 (圖 14)。正向標誌 CD29、CD44 和 STRO-1 不論在未冷凍 組、無磁性冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量三組之間沒有顯著性差 異 (圖 15)。正向標誌 CD73、CD146 和 CD166 在未冷凍組的平均表 現量顯著高於無磁性冷凍組和磁性冷凍組 (p < 0.05)，而磁性冷凍組 在這三者抗體的平均表現量顯著高於無磁性冷凍組 (p < 0.05) (圖 16)。

正向標誌CD90 在未冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量皆顯著高於無 磁性冷凍組 (p < 0.05)，而未冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量，兩 者之間沒有顯著性差異。

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第八節 細胞冷凍解凍後之分化分析

本實驗使用脂分化誘導培養基測試牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方 法冷凍解凍後脂肪化之能力，並與未冷凍組做比較。結果顯示，不論 是未冷凍組、無磁性冷凍組和磁性冷凍組，在脂分化誘導培養基的環 境下培養21 天後，經由 oil red O 染色法確認，皆可明顯看到空泡狀 的脂肪滴形成，脂肪細胞脂肪滴呈現紅色。而不論是未冷凍組、無磁 性冷凍組和磁性冷凍組，在無誘導分化控制組中皆無脂肪細胞脂肪滴 的 呈 色 反 應 (圖 17)。光學顯微鏡觀察拍照之後，使用 100%

isopropanol 將 oil red O 溶解析出且利用 ELISA reader 偵測在 540 nm 的吸光值，並做量化分析，其結果顯示不論在未冷凍組、無磁性冷凍 組和磁性冷凍組的平均吸光值三組之間沒有顯著性差異 (one-way ANOVA) (圖 18)。

本實驗使用骨分化誘導培養基測試牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方 法冷凍解凍後骨化之能力，並與未冷凍組做比較。結果顯示不論是未 冷凍組、無磁性冷凍組和磁性冷凍組，在骨分化誘導培養基的環境下 培養21 天後，經由 alizarin red S 染色法染骨化細胞的鈣沈積，結果 顯示三組皆有紅色鈣沈積的存在，而沒有加入骨分化誘導培養基的控 制組皆沒有紅色鈣沈積的現象 (圖 19)。光學顯微鏡觀察拍照之後，

將alizarin red S 染色進行量化，利用 ELISA reader 偵測在 405 nm 的

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吸光值，並做量化分析。經過one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現無磁性冷凍組的平均吸光值顯著低於未冷凍組和 磁性冷凍組 (p < 0.05)，而磁性冷凍組的平均吸光值與未冷凍組沒有 顯著性差異 (圖 20)。

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