慢速冷凍法

慢速冷凍法為幹細胞的另一種冷凍保存方法，首先應用於老鼠胚 胎幹細胞，使用 10% DMSO 作為冷凍保護劑，以-1℃/min 的降溫速 率，最後置於液態氮桶中的方式成功進行冷凍保存 [32]。然而，將 同樣的冷凍方式應用在人類胚胎幹細胞時，其存活率卻偏低 (8-16%) [40-41]。Ware [42] 建立了一套慢速冷凍法，成功將人類胚胎幹細胞 冷凍解凍後的存活率提昇至(79 ± 15)%。其步驟為將細胞置於含 10%

DMSO 的冷凍液中 15 分鐘，然後在-10℃ 5 分鐘，再以 1℃/min 降溫 速率降至-33℃（至少-30℃以下），接著直接置入液態氮桶中冷凍保 存。之後成體幹細胞的冷凍保存利用此種方法為標準，做部分的調整 改變，也成功地冷凍保存神經幹細胞 [43-46]、造血幹細胞 [47-48] 和

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間葉幹細胞 [49-51]。

細胞內溶液因為沒有夠大的晶核使產生異種成核，故細胞內的水 只有到達 -40℃才有可能結冰，而細胞外的溶液因為存在有異種晶核，

故細胞外相較於細胞內容易且提早形成冰晶。因為水有一種很強的溶 質排斥特性，當水結成冰時，只有非常少的溶質會存在於冰晶中，故 當細胞外冰晶逐漸形成時，剩下的溶質濃度便會增加，而溶質濃度的 增加會降低剩餘細胞外溶液的凝固溫度且會增加細胞外的滲透壓。當 進行慢速冷凍時，由於細胞外冰晶的形成造成滲透壓的增加，而導致 細胞開始脫水直到細胞內外溶液平衡。慢速冷凍所產生的高電解質濃 度會對細胞造成傷害甚至死亡，這種現象稱為溶質效應 (solute effect) 或是溶質傷害 (solute damage) [34]。另一方面，Mazur [52] 提到將紅 血球經慢速冷凍後的存活率與電解質濃度和未形成冰晶的水的比例 有關，當未形成冰晶的水的比例低於20%，也就是說絕大部分的水都 形成冰晶，則存活率僅與其比例有關係，比例越低存活率越低。Pegg [53] 認為這是因為冰晶的形成造成細胞存在的空間變小，細胞與細 胞之間的擠壓有害於細胞之間的交互作用，而造成細胞的死亡，這種 現象稱為聚集效應 (packing effect)。慢速冷凍所導致的細胞脫水會造 成細胞的皺縮，若皺縮量大於細胞所能忍受的程度，則會損害細胞膜 導致細胞死亡 [54]。在降溫過程中，冷凍保護劑的使用可以讓電解

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質的濃度降低，同時減少冰晶的形成，減少細胞的過度聚集，因為冷 凍保護劑如 DMSO 和 glycerol 能夠穿透細胞膜進入細胞，亦可以避 免因細胞脫水所造成的皺縮 [34]。另一方面，Achordoguy [55] 發現 冷凍保護劑可以與細胞膜磷脂雙層的極性端結合，在冷凍過程中穩定 細胞膜避免遭受破壞。然而，慢速冷凍法依舊沒辦法避免冰晶的形成 所可能造成細胞的傷害 [56]。

細胞進行低溫冷凍時必須加入冷凍保存液，而一般冷凍保存液的 組成主要為冷凍保護劑/抗凍劑 (如 DMSO 等)，再搭配不同濃度的血 清或是含血清的培養基。細胞在冷凍過程中加入冷凍保護劑主要可以 減少冰晶的形成而避免細胞的傷害，然而，冷凍保護劑卻有細胞毒性 (cytotoxicity) 和浸入性毒性 (infusion-related toxicity) 的缺點。Fahy [57] 研究認為，DMSO 具有會改變細胞的結構 (cytoskeleton)、基因 表現 (epigenetic events) 與核蛋白質的交聯 (crosslinking of nuclear proteins) 等的細胞毒性。Davis [58] 對於自體骨髓冷凍解凍後移植病 患進行研究，發現病患會產生與 DMSO 浸入有關的副作用，包含呼 吸困難 (83%)、心跳速率降低 (98%) 和暫時性高血壓 (96%)。

Stroncek [59] 則發現絕大部分的冷凍解凍後骨髓移植病患主要會有 浸入性反應如噁心和畏寒。另一方面，冷凍保存液中或多或少都含有 血清，一般進行幹細胞增殖都是使用人類或動物 (如牛、馬) 的血清

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為培養基，其含有賀爾蒙、生長因子及一些生長所需的蛋白質，但是，

人類或動物血清有受愛滋病、狂牛症等病毒或不確定物質污染的疑 慮。

目前，大多數動物細胞的體外培養，都不同程度地依賴血清才能 生長增殖。然而，就細胞生物學觀點來看，因血清的成分十分複雜，

使用血清可能影響實驗結果甚至影響細胞功能表現。就道德方面來說，

動物保護意識的抬頭，抽取胎牛血液的行為容易被質疑。另一方面，

生物醫學、組織工程和幹細胞療法的進展快速，在臨床應用上，使用 複雜甚至來源不清的血清便有很大的疑慮，故使用無血清便成為未來 趨勢。