骨分化步驟

此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組，

兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」，

降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)，

離心後將上澄清液吸掉，加入1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布，

三組實驗組同樣將細胞種在 24-well 細胞培養盤中，每一組分別有控 制組和實驗組兩組，控制組包含3 個 well，實驗組包含 3 個 well，每 個 well 種約 5 × 10⁴ 細胞，經過約 3-4 天後，當細胞達到滿盤時，小 心吸除培養基，控制組每個 well 加入 2 ml α-MEM 培養基，實驗組每 個well 加入 2 ml 骨分化誘導培養基 (osteogenesis induction medium)，

每3 至 4 天換一次，每次每個 well 吸掉 1 ml 加入 1 ml 新的 α-MEM

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培養基或骨分化誘導培養基，經過 21 天誘導分化後，吸除骨分化誘 導培養基，每個well 加入 500 μl DPBS 小心清洗，吸除 DPBS 後，加 入 4% paraformaldehyde 200 μl 於室溫 15 分鐘進行細胞固定，吸除 paraformaldehyde，用 distilled water rinse 兩次 (每次 5-10 分鐘)，利用 alizarin red S 染色法確認骨化細胞鈣沈積，每個 well 加入 alizarin red S 200 μl 於室溫 20 分鐘，吸除 alizarin red S，用 distilled water rinse 四 次，加入 1 ml distilled water 顯微鏡觀察拍照。拍照結束後進行鈣沈 積量化分析 [63]，每個 well 加入 300 μl 10% (v/v) acetic acid，室溫下 incubation with shaking 30 分鐘，將細胞刮下 (包含 acetic acid) 轉移 至1.5 ml 離心小管，Vortex 30 秒，加熱至 85℃ 10 分鐘 (注意避免蓋 子被打開)，轉移至冰上 5 分鐘，離心 15000 g 15 分鐘，吸取 250 μl 上澄清液放入新的 1.5 ml 離心小管，加入 100 μl 10% ammonium hydroxide 中和，吸取等量 100 μl 放入 96-well 細胞培養盤中，以 ELISA reader 在 405 nm 檢測吸光值。

不論是在脂分化或是骨分化實驗中，都是在細胞貼附細胞培養盤 且培養 3-4 天後，待細胞生長複製至滿盤時，才加入誘導培養基進行 誘導分化。細胞培養盤中每個 well 面積一定，能夠佔據的細胞數目 一定，故待細胞滿盤後，不同組別的細胞數會相同，故可排除起始培 養盤中細胞數不同的問題。

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8.3 材料與試劑 1. α-MEM 培養基

2. 脂分化控制組培養基 (α-MEM 培養基 + 0.3% DMSO) 3. 脂分化誘導培養基：

a. α-MEM 培養基

b. 500 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) c. 60 μM indomethacin

d. 0.5 μM hydrocortisone e. 10 μg/ml insulin

Stock solution 作用濃度 500 ml

α-MEM 培養基 498 ml

500 mM IBMX in DMSO 500 μM 500 μl 60 mM indomethacin in DMSO 60 μM 500 μl 0.5 mM hydrocortisone in DMSO 0.5 μM 500 μl 10 mg/ml insulin 10 μg/ml 500 μl 4. 4% paraformaldehyde in DPBS

5. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 6. 100% and 60% isopropanol 7. Oil red O stock solution：

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取 oil red O 粉末 (Sigma O-0625) 0.14 g 溶於 40 ml 100%

isopropanol 中，stir overnight，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾，

儲存於4℃中。

8. Oil red O working solution：

取0.6 ml oil red O stock solution + 0.4 ml distilled water，置於室溫 20 分鐘，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾，於使用前才進行配製。

9. Distilled water

10. 10% ammonium hydroxide 11. 10% (v/v) acetic acid

12. 1.5 ml 離心小管 13. 骨分化誘導培養基：

a. α-MEM 培養基

b. 0.01 μM Dexamethasone solution c. 1.8 mM Glycerol 2-phosphate solution

Stock solution 作用濃度 500 ml

α-MEM 培養基 499 ml

1 mM Dexamethasone solution 0.01 μM 5 μl 0.9 M Glycerol 2-phosphate solution 1.8 mM 1 ml

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14. 2% Alizarin red S solution：

取0.8 g Alizarin red S 加 35 ml distilled water，以 NaOH 調至 pH=4.2，

加distilled water 至 40 ml，儲存於室溫。

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