• 沒有找到結果。

間葉幹細胞已被證實可以從許多不同組織中分離出來,體外培養 仍然具有幹細胞長期自我增殖、更新的能力,以及能夠進一步分化成 為具有特異型態與特定生理功能的體細胞。從牙齒所分離出的牙髓間 葉幹細胞相對於其他幹細胞擁有許多優點,包含牙齒取得的方法相對 來得容易、牙齒取出後較不損傷原先解剖部位系統的生理運作以及從 牙齒中分離出幹細胞的成功率相當高 [64]。由於牙髓間葉幹細胞具 有多元分化、組織工程與臨床治療的高潛能,故必須將其完整地冷凍 保存作為未來的研究與應用。磁性冷凍法藉由磁場震盪水分子來破壞 冰核分子之間氫鍵的結合來達到玻璃化的冷凍保存。本實驗將磁性冷 凍法應用於牙髓間葉幹細胞的冷凍保存,並找出理想的冷凍條件。

本研究結果發現牙髓間葉幹細胞使用90% 胎牛血清加上10%

DMSO作為細胞冷凍保存液,經無磁性冷凍解凍後,利用apoptosis assay經流式細胞儀分析其平均存活率為 (61.0 ± 0.5)%,而未冷凍的 牙髓間葉幹細胞經正常的繼代後分析其平均存活率為 (84.9 ± 2.7)%

(如圖3所示),此結果與之前學者研究結果相似 [65]。而牙髓間葉幹 細胞使用90% 胎牛血清加上10% DMSO作為細胞冷凍保存液,經磁 性冷凍法冷凍解凍後,分析其平均存活率為 (74.8 ± 3.8)%,顯著高於 無磁性冷凍組 (61.0 ± 0.5)% (p < 0.05)。同時,DMSO濃度在 2% 至

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10% 中,同一DMSO濃度下,磁性冷凍組平均存活率均顯著高於無 磁性冷凍組 (如圖5所示)。另一方面,牙髓間葉幹細胞經磁性冷凍解 凍後,DMSO 濃度降低至3% 仍然可以維持存活率與 10% 相當,兩 者之間沒有顯著性差異 (如圖4所示)。影響細胞冷凍解凍後存活率最 重要的關鍵在於冷凍過程與解凍過程中冰晶是否形成 [34],由以上 結果可以合理推論,慢速冷凍法中加入磁場的方式減少了冰晶形成,

不僅可以提昇細胞冷凍解凍後的存活率,同時可以降低所需DMSO的 濃度。

一般冷凍保存液中含有冷凍保護劑 (如 DMSO 等) 和血清或含血 清的培養基,然而為了避免使用血清的疑慮,本實驗除了利用磁性冷 凍法降低 DMSO 所需要的濃度之外,更進一步地嘗試使用無血清冷 凍保存液來進行牙髓間葉幹細胞的冷凍保存。結果顯示,在磁性冷凍 下,牙髓間葉幹細胞不論是使用含血清或是無血清的冷凍保存液,冷 凍解凍後的平均存活率並沒有顯著性差異 (如圖 6 所示),亦即達到 相同效果。另一方面,同樣使用含3% DMSO的無血清冷凍保存液下,

經磁性冷凍法冷凍解凍後的平均存活率 ((76.2 ± 4.3)%) 顯著高於無 磁性冷凍法 ((59.3 ± 2.0)% ) (p < 0.05) (如圖 7 所示)。據此可以推論,

牙髓間葉幹細胞使用含 3% DMSO 的無血清冷凍保存液經磁性冷凍 法冷凍保存後,不僅可以提昇解凍後細胞存活率、降低 DMSO 對細

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胞的傷害同時可以去除使用血清的疑慮。

由前面的實驗結果可以得出牙髓間葉幹細胞最佳化的冷凍方法和 條件,然而欲進一步瞭解解凍後存活下來的幹細胞,是否會因為冷凍 保存而改變了原有的活性、特徵和分化能力。因此,本研究將牙髓間 葉幹細胞加入含3% DMSO 的無血清冷凍保存液中進行磁性冷凍,經 過冷凍保存後解凍,觀察並分析解凍後幹細胞的貼附率、複製率、特 徵表現與分化能力,並與未冷凍組和無磁性冷凍組做比較。

間葉幹細胞屬於貼附型的細胞 (anchorage-dependent cells) [66],

牙髓間葉幹細胞又為間葉幹細胞的一支,牙髓間葉幹細胞經過冷凍解 凍後仍然需要如物理性的基質 (如玻璃或塑膠材質的培養盤) 或是 有機的基質 (如蛋白質,細胞外基質) 貼附而繼續生長增殖或是進行 組織工程應用。故本實驗觀察牙髓間葉幹細胞經冷凍解凍後在細胞培 養盤上的貼附情形,其結果顯示,將未冷凍的牙髓間葉幹細胞貼附後 的MTT assay 吸光值當做 1,而牙髓間葉幹細胞經磁性冷凍和解凍後 的平均貼附率 ((53.3 ± 7.6)%) 顯著高於無磁性冷凍組的平均貼附率 ((39.5 ± 1.1)%) (p < 0.05) (如圖 8 所示) 而磁性冷凍使用僅含 3%

DMSO 及無血清保存牙髓間葉幹細胞。Heng [67] 將骨髓間葉幹細胞 加入含10% DMSO 的冷凍保存液,利用冷凍保存盒進行降溫再放入 液態氮桶中冷凍保存,解凍後利用 MTT assay 觀測細胞貼附率為

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(39.8 ± 0.9)%,此結果與本實驗無磁性冷凍組結果相符,而本實驗磁 性 冷 凍 僅 使 用 含 3% DMSO 及 無 血 清 保 存 牙 髓 幹 細 胞 。 Schmidt-Mende [68] 研究發現細胞經過冷凍和解凍的過程會導致細 胞走向細胞凋亡 (apoptosis)。Heng [67] 認為細胞經冷凍解凍後的貼 附情形與冷凍誘導細胞凋亡 (cryopreservation-induced apoptosis) 的 多寡有關。另一方面,Terry [69] 研究發現,冷凍保存會降低細胞貼 附分子β1-integrin 和 E-cadherin 的表現,進而降低細胞冷凍解凍後的 貼附能力。由以上結果可以推論,本研究以磁性冷凍使用僅含 3%

DMSO 及無血清保存牙髓幹細胞,有效減少了冷凍保存所造成細胞凋 亡的比例以及降低冷凍對於細胞貼附分子的影響,因而增加了細胞冷 凍解凍後的貼附率。

幹細胞最重要的特性之一即為具有長期自我更新複製的能力,故 本實驗利用 BrdU assay 來觀察比較牙髓間葉幹細胞冷凍前後的複製 能力。實驗結果顯示,無磁性冷凍組牙髓間葉幹細胞表現BrdU 佔所 有細胞的平均百分比 ((41.9 ± 5.4)%) 顯著低於未冷凍組 ((73.4 ± 0.9)%) 和磁性冷凍組 ((74.1 ± 4.7)%) (p < 0.05)。而磁性冷凍組的平 均百分比與未冷凍組間則沒有顯著性差異。Honda [70] 研究認為,冷 凍過程會造成細胞DNA 的斷裂而導致細胞的老化,其中可以發現在 BrdU assay 中表現 BrdU 細胞的比例降低以及端粒 (telomere) 長度

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的縮短。 Stachowiak [71] 認為冷凍過程中冰晶的形成與冷凍保護劑 的毒性會破壞DNA 的結構。由此可以推論利用磁性冷凍法減少了冰 晶的形成與 DMSO 的濃度,可以減少冷凍對於細胞 DNA 的破壞,因 而維持幹細胞的自我更新複製能力。

近幾年來研究發現,牙髓間葉幹細胞可以表現間葉幹細胞的表面 標誌如CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD166 和 STRO-1 等 [72-73],而對於屬於造血幹細胞系的表面標誌如 CD14 和 CD34 則不 表現 [10]。本實驗結果顯示牙髓間葉幹細胞不論是經過無磁性冷凍 或是磁性冷凍解凍後,CD14 和 CD34 的表現量都低於 1%,與控制組 的平均表現量沒有顯著性差異,因而可以推論牙髓間葉幹細胞經過冷 凍和解凍後並不會改變牙髓間葉幹細胞屬於間葉幹細胞系,不表現造 血幹細胞系表面標誌CD14 和 CD34 的特徵。

CD29 即為 β1-integrin,能與許多 integrin 的 alpha 次單元形成非共 價鍵結,CD29 位處於細胞膜上,主要功能作為細胞附著於細胞外基 質(extracellular matrix)時的媒介,同時也負責細胞外基質與細胞間 的訊息傳遞。CD44 為 hyaluronic acid receptor,影響細胞遷移以及細 胞與細胞或細胞與細胞間質之間的交互作用,同時亦維持器官與組織 的結構 [73]。Yang [74] 研究指出,表現 STRO-1 的牙髓間葉幹細胞 可以分化成為類牙本質母細胞,此與牙本質的修復有關。本實驗結果

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顯示,牙髓間葉幹細胞不論是經過無磁性冷凍或是磁性冷凍和解凍後,

CD29、CD44 和 STRO-1 的平均表現量與未冷凍組的平均表現量沒有 顯著性差異,此結果與Zhang [75] 和 Xiang [76] 的研究結果相同,

因而可以推論細胞冷凍與解凍並不影響間葉幹細胞表面標誌 CD29、

CD44 和 STRO-1 的表現量。

CD73 與許多細胞間的交互作用有關,包括 T 細胞的活化 [77]、

淋巴球與內皮細胞的附著 [78] 以及 B 細胞和濾泡樹突狀細胞 (follicular dendritic cells) 的交互作用 [79]。CD90 影響細胞內訊息的 傳遞、細胞結構的重組以及調控細胞的移動。CD146 與細胞的貼附、

結構重組、型態、遷移與複製有關 [80] 而 CD166 則與間葉幹細胞的 分化有關 [81]。本實驗結果顯示,牙髓間葉幹細胞不論是經過無磁 性冷凍或是磁性冷凍解凍後,CD73、CD146 和 CD166 的平均表現量 都顯著低於未冷凍組的平均表現量 (p < 0.05),然而只有無磁性冷凍CD90 的平均表現量顯著低於未冷凍組 (p < 0.05)。Haack-Sorensen [82] 研究指出,將骨髓間葉幹細胞經過冷凍解凍後,CD73、CD90 和 CD166 的表現量會顯著性地減少,與本實驗結果相似。不過,本 實驗磁性冷凍組 CD73、CD90、CD146 和 CD166 的平均表現量皆顯 著高於無磁性冷凍組 (p < 0.05),甚至 CD90 的平均表現量與未冷凍 組相當。由以上結果可以推論,磁性冷凍法相較於無磁性冷凍法,較

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能提昇間葉幹細胞的表面標誌 CD73、CD146 和 CD166 冷凍解凍後 的平均表現量,甚至維持CD90 未冷凍時的表現量,因而減少冷凍和 解凍的過程對於細胞功能的表現。

幹細胞經過適當的誘導後,可以分化成為特定功能的體細胞,此 即為幹細胞另一個重要的特性,故本實驗欲進一步瞭解牙髓幹細胞經 過冷凍與解凍後,其分化能力是否受到影響。結果顯示不論是未冷凍 組、無磁性冷凍組和磁性冷凍組,在脂分化誘導培養基的環境下培養 21 天後,皆可明顯看到空泡狀的脂肪滴形成,經由 oil red O 染色法 確認,脂肪細胞呈現紅色。而未加入脂分化誘導組,同樣培養 21 天 後以oil red O進行脂肪細胞的染色確認,結果顯示,不論是未冷凍組、

無磁性冷凍組和磁性冷凍組,牙髓間葉幹細胞皆無脂肪細胞的呈色反 應 (圖 14)。之後經過量化分析,未冷凍組、無磁性冷凍組和磁性冷 凍組的平均吸光值沒有顯著性差異 (圖 15)。因此可以推論,牙髓間 葉幹細胞經過冷凍和解凍後並不會影響脂分化的誘導。

在骨分化誘導方面,結果顯示,不論是未冷凍組、無磁性冷凍組 和磁性冷凍組,在骨分化誘導培養基的環境下培養三週後,經由 alizarin red S 染色法染骨化細胞的鈣沈積,結果顯示三組皆有紅色鈣 沈積的存在,而沒有加入骨分化誘導培養基的控制組皆沒有紅色鈣沈 積的現象 (圖 16)。經過量化分析後顯示,磁性冷凍組的平均吸光值

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