第五章 研究材料與方法
第六節 細胞冷凍解凍後之複製率分析
此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組，
兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」，
降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)，
離心後將上澄清液吸掉，加入1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布，
三組實驗同樣將細胞培養在細胞培養玻片 (chamber slide) 上，每個 well 約種 5000 cells，經過 24 小時之後，用 DPBS 沖洗吸掉未貼附的 細胞，加入200 μl Bromodeoxyuridine (BrdU) solution，置入細胞培養 箱中，經過24 小時後吸除 BrdU solution，用 DPBS wash 數次，加入 70% alcohol 於 4℃ 15-30 分鐘使細胞固定，使用 distilled water wash 三次 (每次 2 分鐘)，使用 distilled water (125 μl) 1：1 稀釋 Reagent 2 (3 滴)，每個 chamber 加入 125 μl 後，作用 30 分鐘，吸除 Reagent 2，用 DPBS wash 三次 (每次 2 分鐘)，加入 Reagent 3 作用 10 分鐘，吸除 Reagent 3，不 wash，加入 Reagent 4 作用 30-60 分鐘，吸除 Reagent 4，
用 PBS wash 三次 (每次 2 分鐘)，加入 Reagent 5 作用 10 分鐘，吸除 Reagent 5，用 DPBS wash 三次 (每次 2 分鐘)。1 ml distilled water 各
35
加1 滴 Reagent 6A、6B 和 6C，混合均勻且避光，每個 chamber 加入 125 μl，作用 2-5 分鐘後，吸除並用 distilled water wash，接著加入 Reagent 7 作用 1-2 分鐘後，吸除並加入 DPBS 等待 30 秒直到變藍色，
使用distilled water wash，最後加入 200 μl distilled water 於顯微鏡下 觀察照相。
6.2 細胞複製率分析（流式細胞儀）
此實驗同樣分成三組 (如同 6.1 細胞免疫染色分組)，使用流式細 胞儀進行BrdU assay 的量化分析，計算細胞染到 anti-BrdU antibody conjugated with phycoerythrin (PE) 佔所有細胞的比例。將細胞培養在 6-well 細胞培養盤中，每一組分別有控制組和實驗組，每個 well 約種 2 × 105 cells，經過 24 小時之後，吸除細胞培養盤中的培養基，用 DPBS 沖洗吸掉未貼附的細胞，控制組加入 α-MEM 培養基，實驗組則每個 well 加入 3 ml BrdU solution，置入細胞培養箱中，經過 24 小時培養 之後，吸除BrdU solution，用 PBS wash 數次，用 0.25% Trypsin/EDTA 收集細胞至 15 ml 離心管，離心去除上澄清液，慢慢加入 ice cold 70%
alcohol 200 μl 混合均勻，於室溫反應 20 分鐘，每一管離心管加入 1 ml wash buffer，混合均勻，離心，去除澄清液，加入 100 μl denaturing solution (2 M HCl)，混合均勻，於室溫培養 20 分鐘，加入 1 ml wash
36
buffer，混合均勻，離心，去除澄清液，加入 500 μl 0.1 M sodium borate solution，於室溫培養 2 分鐘，加入 1 ml 的 wash buffer，混合均勻，
離心，去除澄清液，每管加入 100 μl dilution buffer，控制組加入 5 μl PE Mouse IgG1κ Isotype Control，實驗組則加入 5 μl PE Mouse Anti-BrdU 於室溫培養 20 分鐘，加入 500 μl PBS 混合均勻，流式細胞儀分析。
6.3 材料與試劑
1. Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling reagent (Invitrogen 696030A) 2. Bromodeoxyuridine (BrdU) solution：
BrdU labeling reagent 以 α-MEM 培養基 1：100 稀釋，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾
3. BrdU staining kit (Invitrogen 93-3943)：Reagent 2-7 Reagent 2：Denaturing solution
Reagent 3：Blocking solution
Reagent 4：Biotinylated Mouse Anti-BrdU Reagent 5：Streptavidin-Peroxidase
Reagent 6A：Substrate Buffer (20×) Reagent 6B：DAB Concentrate (20×)
Reagent 6C：0.6% Hydrogen Peroxide Concentrate (20×) Reagent 7：Hematoxylin
37
4. 細 胞 培 養 玻 片 (Lab-Tek II Chamber Slide, Nalge Nunc International 154534)
5. 6-well 細胞培養盤 (Costar 3516) 6. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.)
7. PE Mouse Anti-BrdU Set (BD PharmingenTM 556029) a. PE Mouse IgG1κ Isotype Control
b. PE Mouse Anti-BrdU
8. Washing buffer (DPBS + 0.5% BSA) 9. Denaturing solution (2 M HCl)
10. Dilution buffer (DPBS + 0.5% Tween-20 + 0.5% BSA) 11. 0.1 M sodium borate solution (Sigma, U.S.A.)
12. Ice cold 70% alcohol 13. Distilled water
38
第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析