磁性冷凍對牙髓間葉幹細胞之冷凍保存研究
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(2) 致謝 回想起當初剛考進研究所的時候，心中充滿著喜悅，然而，不論 是對於臨床的工作以及過去不熟悉的基礎研究領域方面，卻是帶著戒 慎恐懼的心情來學習。如今，直到我論文完成的這一刻，當我提筆要 寫致謝時，才驚覺，轉眼間研究所三年的日子已經接近尾聲了。這一 路來感謝許多人的幫助與指引，讓我在學術知識與個人發展上得到許 多充實與成長，才會有如今的研究成果。首先最要感謝的是李勝揚所 長，提供了我很好的學習與研究環境，同時，對於邏輯思考上的訓練 和矯正臨床工作上的指導，都讓我受益匪淺。再來要感謝楊維中老師 在實驗與研究上不厭其煩地給我指導與幫忙，在我繁忙的臨床工作之 餘，能夠順利地完成我的實驗。關於臨床方面，由衷地感謝李勝揚所 長、林利香老師、蔡吉陽老師、蘇志鵬老師、許必靈老師以及蔣金玉 老師對於我在齒顎矯正臨床上的指導。此外，本篇論文的完成承蒙鄭 景暉老師、郭宗甫老師和黃彥華老師的提點與指正，以及吳育偉博士、 熊兆男小姐、偉智、淑惠、雅惠在我實驗技術上的幫忙。 另一方面，非常感謝楊維中老師實驗室的全體同仁，劉為麟學長、 傅玉崙學姊、書君、愉萱、曉玲、詩恩、陳怡、采真、憲汛和志僑陪 我度過許多與實驗奮戰的日子，也謝謝你們在實驗上給我的協助與指 導。同時我也要感謝萬芳醫院的矯正團隊，芝瑜學姊、宴莊學長、寶.
(3) 漳學長、雅齡、福源、慧茹、博遠和東翰平時給我的鼓勵與支持。另 外也要特別感謝釗炫，這三年來一起共患難，也幫了我很多忙，平時 也願意聽我吐苦水給我鼓勵。真的很感謝你們這三年來的陪伴與支持。 此外我也要感謝我的朋友們，林俊宏、吳嘉真、濟鴻、世傑、易辰， 都願意在我低潮沮喪的時候給我鼓勵與支持。 最後也是最重要的，我要感謝我的家人，我的爸爸和媽媽，在我 從小到大的求學歷程中，對我全心全意的付出與照顧，讓我毫無後顧 之憂，以及感謝我的妹妹，不時地給我鼓勵，讓我充滿溫暖。回首這 三年來受到的幫助真的很多很多，心中的感激實在很難言語形容，我 由衷地感謝你們，我愛你們，謝謝。.
(4) 目錄 目錄............................................................................................................. I 圖目錄...................................................................................................... IV 表目錄...................................................................................................... VI 中文摘要.................................................................................................VII Abstract ................................................................................................... IX 第一章 文獻回顧 ......................................................................................1 第一節 幹細胞的介紹 .......................................................................1 第二節 間葉幹細胞............................................................................3 第三節 冷凍保存之目的 ...................................................................5 第四節 冷凍保存之發展 ...................................................................6 第五節 幹細胞之冷凍保存 ...............................................................8 5.1 玻璃化 (vitrification) ............................................................8 5.2 極快速冷凍法 ........................................................................9 5.3 慢速冷凍法 .......................................................................... 11 5.4 磁性冷凍法 ....................................................................... 14 第二章 研究動機 ....................................................................................16 第三章 研究目的 ....................................................................................18 第四章 研究假說 ....................................................................................19 第五章 研究材料與方法 ........................................................................20 第一節 牙髓間葉幹細胞初代培養與繼代 .....................................20 1.1 牙髓間葉幹細胞初代培養步驟..........................................20 1.2 牙髓間葉幹細胞繼代培養..................................................21 1.3 材料與試劑 ..........................................................................21 第二節 細胞冷凍..............................................................................24 2.1 細胞冷凍步驟......................................................................24 2.2 材料與設備 ..........................................................................25 I.
(5) 第三節 細胞解凍..............................................................................27 3.1 細胞解凍步驟 ......................................................................27 3.2 材料與試劑 ..........................................................................27 第四節 細胞冷凍解凍後存活率分析 .............................................28 4.1 存活率分析步驟..................................................................28 4.2 試劑與設備 ..........................................................................29 4.3 無磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解 凍後存活率分析 .................................................................29 4.4 磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍 後存活率分析 .....................................................................30 4.5 使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細 胞存活率分析 .....................................................................30 4.6 使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁性 冷凍下之細胞存活率分析.................................................31 第五節 細胞冷凍解凍後之貼附率分析 .........................................32 5.1 細胞貼附率分析..................................................................32 5.2 材料與試劑 ..........................................................................33 第六節 細胞冷凍解凍後之複製率分析 .........................................34 6.1 細胞複製率分析 (細胞免疫染色) .....................................34 6.2 細胞複製率分析 (流式細胞儀) .........................................35 6.3 材料與試劑 ..........................................................................36 第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析 ....38 7.1 間葉幹細胞之抗體..............................................................38 7.2 流式細胞儀前置處理..........................................................38 7.3 材料與試劑 ..........................................................................39 第八節 細胞冷凍解凍後之分化分析 .............................................40 8.1 脂肪分化步驟 ......................................................................40 II.
(6) 8.2 骨分化步驟 ..........................................................................41 8.3 材料與試劑 ..........................................................................43 第九節 統計分析..............................................................................46 第六章 實驗結果 ....................................................................................47 第一節 無磁性冷凍下使用不同 DMSO 濃度之細胞存活率分析 47 第二節 磁性冷凍下使用不同 DMSO 濃度之細胞存活率分析 ...48 第三節 使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細 胞存活率分析 ....................................................................49 第四節 使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁 性冷凍下之細胞存活率分析 ............................................50 第五節 細胞冷凍解凍後之貼附率分析 .........................................51 第六節 細胞冷凍解凍後之複製率分析 .........................................52 第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析 ....53 第八節 細胞冷凍解凍後之分化分析 .............................................54 第七章 討論.............................................................................................56 第八章 結論.............................................................................................64 第九章 參考文獻 ....................................................................................65. III.
(7) 圖目錄 圖 1：牙髓間葉幹細胞培養情形 ..........................................................77 圖 2：磁性程式降溫儀 ..........................................................................78 圖 3：無磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後 存活率分析 ..................................................................................79 圖 4：磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後存 活率分析 ......................................................................................80 圖 5：不同 DMSO 濃度下分別比較無磁性冷凍與磁性冷凍之牙髓間 葉幹細胞存活率分析 ..................................................................81 圖 6：使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細胞存 活率分析 ......................................................................................82 圖 7：使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁性冷凍 下之細胞存活率分析 ..................................................................83 圖 8：細胞冷凍解凍後之貼附率分析 ..................................................84 圖 9：牙髓間葉幹細胞以 BrdU assay 細胞免疫染色觀察..................85 圖 10：BrdU assay 之細胞複製率量化分析 .........................................86 圖 11：利用流式細胞儀分析未冷凍組牙髓間葉幹細胞表面標誌的表 現量 ............................................................................................87 圖 12：利用流式細胞儀分析無磁性冷凍組牙髓間葉幹細胞表面標誌 的表現量 ....................................................................................88 圖 13：利用流式細胞儀分析磁性冷凍組牙髓間葉幹細胞表面標誌的 表現量 ........................................................................................89 圖 14：利用流式細胞儀分析牙髓間葉幹細胞 CD14 和 CD34 表現量 ....................................................................................................90 圖 15：利用流式細胞儀分析牙髓間葉幹細胞 CD29、CD44 和 STRO-1 表現量 ........................................................................................91 圖 16：利用流式細胞儀分析牙髓間葉幹細胞 CD73、CD90、CD146 IV.
(8) 和 CD166 表現量 .......................................................................92 圖 17：牙髓間葉幹細胞脂分化誘導 21 天 ..........................................93 圖 18：牙髓間葉幹細胞脂分化誘導 21 天，以 oil red O 染色法確認脂 肪滴後進行量化分析 ................................................................94 圖 19：牙髓間葉幹細胞骨分化誘導 21 天 ..........................................95 圖 20：牙髓間葉幹細胞骨分化誘導 21 天，以 alizarin red S 染色法確 定鈣沈積後進行量化分析 ........................................................96. V.
(9) 表目錄 表 1：利用流式細胞儀分析牙髓間葉幹細胞正向（Positive）與負向 （Negative）表面標誌的表現量 .............................................. 97. VI.
(10) 中文摘要 細胞的冷凍保存是重要的生物技術之一。冷凍保存技術與幹細胞 萃取培養技術的結合，使得幹細胞的研究與應用不受到時間與空間的 限制。針對幹細胞冷凍保存，傳統慢速冷凍法無法避免冰晶形成而造 成細胞的傷害，近年來的玻璃化冷凍方式避免了冰晶的形成，但藉由 極快速冷凍達到玻璃化需要高濃度冷凍保護劑，卻有細胞毒性問題。 Kaku 率先使用磁性程式降溫儀成功地將牙周韌帶細胞進行長期低溫 冷凍保存，其利用慢速冷凍法加入磁場的方式達到玻璃化，又稱磁性 冷凍，避免了冰晶的形成，並成功應用於牙齒冷凍保存與再植。細胞 進行傳統慢速冷凍時必須加入冷凍保護劑 (如 10% DMSO) 以減少 冰晶的傷害，本研究則嘗試將磁性冷凍法應用在牙髓間葉幹細胞的冷 凍保存上，希望利用慢速冷凍法加入磁場的方式來降低 DMSO 所需 要的濃度，且配合無血清冷凍保存液，進一步更有效地保存牙髓幹細 胞的數量、活性、特徵以及分化能力。本研究將牙髓間葉幹細胞分別 在不同 DMSO 濃度下進行無磁性與磁性冷凍，並且比較有無血清對 於存活率之影響。結果顯示，牙髓間葉幹細胞加入含 3% DMSO 的無 血清冷凍保存液中進行磁性冷凍保存，為本實驗所找出的最佳條件， 利用此一條件來觀察並分析解凍後牙髓間葉幹細胞的貼附率、複製率、 特徵表現與分化能力，並與未冷凍組和無磁性冷凍組做比較。進一步 VII.
(11) 結果顯示，無論在存活率、貼附率、複製率以及 CD73、CD90、CD146 和 CD166 的表現量上，磁性冷凍法組皆顯著優於無磁性冷凍組 (p < 0.05)。磁性冷凍法相較於無磁性冷凍法，可以將牙髓間葉幹細胞在量 方面，不僅可以降低 DMSO 所需要的濃度至 3%，且提升細胞冷凍解 凍後的存活率；在質方面，亦可以維持細胞未冷凍前的複製與分化能 力，甚至可以提昇細胞冷凍解凍後的貼附率與幹細胞的特徵表現。顯 示，磁性冷凍法提供了牙髓間葉幹細胞完整且有效的冷凍保存之重要 參考。 關鍵詞：牙髓間葉幹細胞、冷凍保存、磁性冷凍法. VIII.
(12) Abstract A reliable method for the cryopreservation of human mesenchymal stem cells (MSCs) which are capable of self-renewal and multiple differentiations is needed for regenerative medicine or tissue engineering. A cryoprotectant and a cooling system are required for stem cell preservation. Very rapid cooling enables vitrification which is the creation of an amorphous glassy solid from a liquid to avoid ice crystal formation which may injure cells. However, high-concentration of cryoprotectants can be chemically toxic to cells. A magnetic cryopreservation method using a program freezer with a magnetic field was established by ABI coroperation. This method has been successfully used to preserve human periodontal ligament cells for teeth banking and tooth re-implantation. The objective of this study was to test whether this program freezer can be used for the cryopreservation of dental pulp stem cells (DPSCs), an MSC population exhibiting high proliferation rate and multiple differentiation potentials, for application in regenerative medicine or tissue engineering. In addition, we determined whether this method can reduce the need for a cryoprotectant and preserve the characteristics and differentiation ability of DPSCs. For this purpose, we compared the post-thawed viability, seeding efficiency, proliferation rate, expression of MSCs markers and differentiation ability of DPSCs subjected to magnetic cryopreservation and those subjected to conventional slow-freezing. The post-thawed viability, seeding efficiency, and proliferation rate after magnetic cryopreservation with a serum-free cryopreservation medium containing 3% dimethyl sulfoxide were found IX.
(13) to be superior to those after conventional slow -freezing. In addition, magnetic cryopreservation preserved the ability of post-thawed DPSCs to express. MSC. markers. and. induce. osteogenic. and. adipogenic. differentiations. Thus, magnetic cryopreservation may be a reliable and effective method for the cryopreservation of DPSCs and other MSCs.. Keywords: Mesenchymal stem cells, Dental pulp stem cells, Magnetic cryopreservation. X.
(14) 第一章 第一節. 文獻回顧. 幹細胞的介紹. 幹細胞 (stem cells) 是一群尚未完全分化的細胞，具有長期分裂增 殖成另一個與本身完全相同的細胞，即所謂自我更新 (self- renewnal) 之能力，同時分化成為多種特定功能體細胞等特性 [1]。幹細胞對於 生命體由胚胎到成熟個體的過程中之細胞增生、分化以及組織修復等 扮演關鍵性角色。除了胚胎擁有豐富的幹細胞來源外，發育成熟後， 幹細胞仍然普遍存在於個體中，擔負著各組織及器官細胞更新與受傷 修復等重責大任。 幹細胞依照功能可以分成全能幹細胞 (totipotent stem cells)、多功 能幹細胞 (pluripotent stem cells) 和多潛能幹細胞 (multipotent stem cells) [2]。卵子和精子的融合產生受精卵，而受精卵在形成胚胎過程 中八細胞期之前任一細胞皆是全能幹細胞，其具有發展成獨立完整個 體的能力，同卵雙胞胎或多胞胎就是這樣子來的。在經過大約四天後， 細胞分裂許多次，這些細胞排列成特殊的囊胚結構。囊胚的外層為一 層細胞，內部空心並含有一團內部細胞團。外層細胞會在母體的子宮 內繼續形成胎盤及其他供應胚胎生長發育所需的組織，內部細胞團則 會發育成人體的各個組織。內部細胞團的細胞為多功能幹細胞，它們 可以分化產生各種不同形態的細胞，進而發育成多種組織。但是沒有 1.
(15) 了胎盤及其他供應胚胎生長發育所需的組織，內部細胞團則無法發育 為一個完整的個體。除了胚胎中的胚胎幹細胞外，在成人的器官或組 織中，也可以發現幹細胞的蹤跡，這些細胞統稱為成體幹細胞。這些 只能分化成特定組織或器官等特定族群的細胞即被歸類為多潛能幹 細胞。 因此，幹細胞依照發育過程出現先後和分佈，可分成胚胎幹細胞 與成體幹細胞。目前研究發現有成體幹細胞的組織，包括骨髓、周邊 血液、大腦、脊椎、牙齒組織、血管、骨骼肌、皮膚上皮、消化器官 的表皮、眼角膜、視網膜、肝臟、脾臟及大腿骨等，因為成體幹細胞 屬於多潛能幹細胞，其所能分化的細胞及組織種類較胚胎幹細胞少， 但卻可以避免胚胎幹細胞在使用道德上的爭議。成體幹細胞依照特性 可以分為造血幹細胞、間葉幹細胞 (mesenchymal stem cells) 、神經 幹細胞 (neural stem cells) 和上皮幹細胞 (epithelial stem cells)。. 2.
(16) 第二節. 間葉幹細胞. Till 和 McCulloch [3]分析老鼠骨髓中的成分，發現其中有一種細 胞可以不斷地增生且可以分化成血球細胞，他們就把這種細胞稱做造 血幹細胞。此外，在骨髓中亦存在一群非造血系統的幹細胞，此類幹 細胞可以分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞，Caplan [4] 將此幹細胞稱為間葉幹細胞。雖然目前間葉幹細胞沒有決定性的細胞 表面標誌可供辨識，但是已有研究顯示間葉幹細胞可以表現特定細胞 表面標誌，如CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1 [5]。 研究發現，間葉幹細胞除了可以從骨髓中獲得，目前亦可來自許多不 同組織，包括髓質骨 (trabecular bone) [6]、關節液 [7]、脂肪組織 [8]、 臍帶血 [9] 和牙髓組織 [10-11]。成體幹細胞的主要功能為維持一特 定細胞族群在人體內的平衡狀態，以便補充受傷或死亡的細胞。此外， 成體幹細胞在適當的體外培養環境下，能夠分化成為許多不同種類的 成熟體細胞。間葉幹細胞在培養基中加入不同的誘導物質，可以使之 分化成源自胚胎時期中胚層的各種組織細胞，包括骨細胞、軟骨細胞、 脂肪細胞和肌肉細胞 [12]。近幾年學者亦發現間葉幹細胞可以分化 成源自外胚層的神經細胞，這些神經細胞在體外證實具有各種成熟神 經細胞，如神經 (neuron)、星狀細胞 (astrocyte)、寡突膠質細胞 (oligodendrocyte) 的特徵表現 [13]。另一方面，間葉幹細胞亦可分化 3.
(17) 成為源自內胚層的肝臟細胞，並證實具有正常肝臟細胞的功能特性， 如製造白蛋白、儲存肝醣、分泌尿素和解毒等 [14]。在牙醫學方面， Gronthos [10] 等人於2000年由19-29歲的成年人未萌發第三大臼齒牙 髓腔內的組織成功分離出牙髓幹細胞，亦證實具有間葉幹細胞的特徵 與分化能力，同時，將牙髓幹細胞配合羥磷灰石/三鈣磷酸鹽 (HA/TCP) 為材料的支架植入免疫不全裸鼠皮下，約六週後可在裸鼠 植入部位發現類牙齒組織 [10]，自此，關於牙髓幹細胞組織工程與 再生醫學上的研究如雨後春筍般蓬勃地發展。由於間葉幹細胞取得的 來源多元且培養技術已確立完整，同時具有多元而廣泛的分化可塑性， 而且具有免疫調節的能力，使得間葉幹細胞未來可廣為應用在細胞療 法、組織工程及再生醫學上。目前已有將間葉幹細胞應用在人類臨床 治療上的初步研究結果，如急性心肌梗塞 (acute myocardial infarction) 後心肌受損的修復 [15]、成骨不全症 (osteogenesis imperfecta) 病患 骨折的修復 [16] 和組織移植排斥併發症 (graft versus host disease, GVHD) 的治療 [17]。由於間葉幹細胞多元的潛能與臨床應用的高價 值，如何將已建立的幹細胞完整地長期保存，便成為愈發重要的課 題。. 4.
(18) 第三節 冷凍保存之目的 目前幹細胞的研究與發展極為迅速，而將萃取培養的幹細胞做完 整的長期保存，是本研究所要努力的目標。細胞冷凍保存的優點，諸 如 (一)、避免細胞持續生長可能發生基因突變、細胞變異、老化以 及微生物污染的可能性，(二)、無需長期維持細胞的生長，故可以節 省人力、時間、細胞培養耗材的開銷，(三)、避免細胞培養器故障造 成細胞損傷的可能性，(四)、避免細胞之間交叉感染，(五)、長期以 後之使用，(六)、方便細胞的運輸傳遞等。. 5.
(19) 第四節 冷凍保存之發展 生物的長期保存與利用一直是冷凍保存學 (cryopreservation) 所 努力的目標，然而真正實現生物體低溫保存之概念始自於 1949 年 Polge [18] 成功地利用甘油將家禽的精子進行冷凍保存而不死亡，隔 年，Smith [19] 亦成功利用甘油將紅血球進行冷凍保存而沒有造成血 球溶解。Doebbler [20] 透過較快速的冷凍與解凍以及使用聚乙烯吡咯 烷酮 (polyvinylpyrrolidone) 作為冷凍保護劑成功地將紅血球冷凍保 存。Lovelock 為一位嚴謹的冷凍生物學家，具有生物物理學的證書， 在 1959 年 與 Bishop [21] 共 同 發 現 使 用 二 甲 基 亞碸. (Dimethyl. sulfoxide 或 DMSO) 可以使得細胞在冷凍保存過程中避免冷凍傷害。 1960 年，Luyet [22] 成立了冷凍生物學學會，並且強調冷凍溫度、降 溫速率與解凍速率對於冰晶的形成影響很大。Mazur 將物理學與數學 的概念以及運算技巧帶進這個領域，更多突破性且嚴謹的研究取代了 過去以經驗為主但沒有系統性的實驗，激發了往後更多人對於冷凍傷 害更深入且嚴謹的探討。Mazur [23] 提出了雙變因假說 (Two-factor hypothesis)，當細胞使用較快的冷凍速率時，由於溫度的快速下降， 細胞內的水份來不及排出細胞膜外，則細胞內容易產生大量的冰晶， 冰晶的產生足以傷害細胞內胞器的微結構甚至是細胞膜的結構；當細 胞使用較慢的冷凍速率時，由於細胞內的水份有足夠的時間排出細胞 6.
(20) 外，以達成熱與水力間的平衡 (thermal and hydraulic equilibrium) [24]， 當細胞外溶液開始結冰後，水分子因結冰析出而使得胞外溶液濃度提 高，伴隨著滲透壓的提高，為了平衡細胞內外之滲透壓，細胞內之水 分子通過細胞膜往外流，細胞則因脫水過程而使得體積縮小，因而增 加了作用在細胞膜表面上的壓力，這會導致細胞膜的分離及崩潰，造 成細胞膜不可恢復的損傷 [25]，然而，冷凍保護劑的使用減少了生 物細胞冷凍保存過程中冷凍傷害的問題。Whittingham [26] 首次實現 了小鼠胚胎超低溫冷凍保存，之後 Trounson 和 Mohr [27] 成功地將 此方法應用在人胚胎的冷凍保存。Rall 和 Fathy [28] 首先利用極快速 冷凍達到玻璃化來改善慢速降溫冷凍容易造成冰晶形成之缺點，並成 功應用於鼠胚的冷凍保存上。而 Kaku 等人 [29] 則率先使用磁性程 式降溫儀成功地將牙周韌帶細胞進行長期低溫冷凍保存，利用慢速冷 凍 法 加 入 磁 場 的 方 式 達 到 玻 璃 化 (vitrification) ， 又 稱 磁 性 冷 凍 (magnetic cryopreservation)，減少了冰晶的形成，並成功應用於牙齒 冷凍保存與再植上。Lee 等人 [30] 更進一步研究指出，將人類牙齒 經過磁性冷凍解凍後，約 73% 的牙齒可以成功培養出牙髓幹細胞。. 7.
(21) 第五節 幹細胞之冷凍保存 現今對於幹細胞的冷凍保存，主要有兩種不同方式，極快速冷凍 法與慢速冷凍法 [31]，極快速冷凍法即利用加入高濃度的冷凍保護 劑，然後直接置入液態氮的方式達到玻璃化冷凍，最常使用在生殖細 胞的冷凍保存，如精子、卵母細胞、受精卵和胚胎，近年來已廣為應 用在幹細胞的冷凍保存上，後來的學者將極快速冷凍法與玻璃化冷凍 法混為一談，只要提到玻璃化冷凍法即是用極快速冷凍法達到玻璃化。 而慢速冷凍法卻是最先發展的冷凍方法，以 -1℃/min 的速率進行降 溫，最後置入液態氮中冷凍保存，是幹細胞冷凍保存最早使用的方式 [32]。而磁性冷凍法的發明，則提供了達到玻璃化冷凍的另一種選擇， 不僅可以避免極快速冷凍法高濃度冷凍保護劑的細胞傷害，同時可以 減少慢速冷凍法細胞內冰晶的形成。. 5.1 玻璃化 (vitrification) 冰的形成首先需要先有晶核 (crystal nucleus)，水分子以規則的排 列附著於晶核上而讓冰晶逐漸生長。水的凝固點雖然在攝氏零度，但 是一般狀態下，在攝氏零度時，因為缺乏夠大的晶核，水分子無法附 著排列而不容易結成冰。通常在 -10 ~ -18℃時，水溶液中非水分子 物質可以當作晶核而讓水分子附著其上形成冰晶，此種現象稱為異種 8.
(22) 成核 (heterogeneous nucleation)。純水因缺乏其他物質幫助冰晶形成， 只有在 -40℃時水分子可以隨機地形成晶核而讓其他水分子附著結 成冰晶，此種狀況稱為同種成核 (homogeneous nucleation) [33]。若是 水能夠在 -138℃以下還未形成冰晶，則水會以一種無定形玻璃相的 固體狀態存在。當液體形成一種非結晶無定形玻璃相的固體狀態，此 種過程稱為玻璃化 (vitrification)，此種形成非結晶的過程便可成為冷 凍保存最理想的方法 [34]。. 5.2 極快速冷凍法 傳統上達到玻璃化狀態的方法最廣為人知者有兩種，第一種是利 用物理方式以 -106℃/sec 的降溫速率進行冷凍達到玻璃化，然而一般 狀態下，細胞、組織甚至是器官很難達成此降溫速率，目前只有極小 的水分子直接與液態氮結合才能達成，第二種則是加入高濃度冷凍保 護劑直接置入液態氮中來達到玻璃化。Rall 和 Fathy [28] 首先利用極 快速冷凍法成功將鼠胚玻璃化冷凍保存，其中所使用的玻璃化溶液含 有冷凍保護劑成分，包括有 20.5% DMSO、15.5% acetamide 、10% propylene glycol 和 6% polyethylene glycol。極快速冷凍法下，細胞溶 液必須含有高濃度冷凍保護劑，在急速冷凍過程中才能產生所謂玻璃 化現象，然而，多數冷凍保護劑在高濃度狀態下均具有相當毒性。達 9.
(23) 到玻璃化所需要冷凍保護劑的濃度與降溫速率成反比，因此，決定極 快速冷凍法成功最關鍵的因素是如何降低冷凍保護劑的毒性與提高 降溫速率。在進行極快速冷凍法之前且總濃度不變之原則下，採用由 低濃度漸進至高濃度兩階段處理將有助於降低冷凍保護劑之毒性 [31]。 另一方面，玻璃化冷凍之降溫速率與細胞的載具有關，由最 早使用 0.25 ml 麥管，至開放式拉製麥管 (Open pulled straws, OPS) [35]、電子顯微鏡的格網 [36]、冷凍線圈 (cryoloop) [37] 及玻璃微吸 管 [38] 等，不外乎是以減少溶液容積及提升降溫速率為主要目的。 胚胎幹細胞極快速玻璃化冷凍保存的標準流程已經被完整建立 [31]，其步驟先將胚胎幹細胞的細胞團浸泡在 200 μl 含有 10% DMSO 與 10% ethylene glycol (EG) 的一號玻璃化溶液 (vitrification solution 1, VS1) 中 1 分鐘，再吸起來移入 100 μl 含有 20% DMSO 與 20% EG 的二號玻璃化溶液 (vitrification solution 2, VS2) 中 25 秒，然後再吸 起來移入另一個 100 μl 二號玻璃化溶液中，接著馬上收集吸取細胞團 在另一細胞培養盤上形成一個 3-5 μl 的水珠，利用毛細管原理用冷凍 麥管將細胞團吸起，最後將冷凍麥管直接置入液態氮中，即完成極快 速玻璃化冷凍。解凍時，將冷凍麥管從液態氮中取出，三秒內將細胞 團浸泡在含有 0.2 M sucrose 的解凍液中 1 分鐘，然後再移入 0.1 M. 10.
(24) surcrose 的解凍液中 5 分鐘，接著在不含 sucrose 的培養液中浸泡 5 分鐘兩次，最後移入細胞培養盤中培養。. 極快速冷凍法的缺點在於高濃度的冷凍保護劑會對細胞產生毒性， 同時高濃度冷凍保護劑的加入和移除所產生滲透壓急遽的變化亦會 造成細胞的死亡 [39]。同時，極快速冷凍法的操作繁複且需具備熟 練操作技術，此外每次儲存的量較少，不適用於需要大量儲存的細胞 銀行。. 5.3 慢速冷凍法 慢速冷凍法為幹細胞的另一種冷凍保存方法，首先應用於老鼠胚 胎幹細胞，使用 10% DMSO 作為冷凍保護劑，以-1℃/min 的降溫速 率，最後置於液態氮桶中的方式成功進行冷凍保存 [32]。然而，將 同樣的冷凍方式應用在人類胚胎幹細胞時，其存活率卻偏低 (8-16%) [40-41]。Ware [42] 建立了一套慢速冷凍法，成功將人類胚胎幹細胞 冷凍解凍後的存活率提昇至(79 ± 15)%。其步驟為將細胞置於含 10% DMSO 的冷凍液中 15 分鐘，然後在-10℃ 5 分鐘，再以 1℃/min 降溫 速率降至-33℃（至少-30℃以下），接著直接置入液態氮桶中冷凍保 存。之後成體幹細胞的冷凍保存利用此種方法為標準，做部分的調整 改變，也成功地冷凍保存神經幹細胞 [43-46]、造血幹細胞 [47-48] 和 11.
(25) 間葉幹細胞 [49-51]。 細胞內溶液因為沒有夠大的晶核使產生異種成核，故細胞內的水 只有到達 -40℃才有可能結冰，而細胞外的溶液因為存在有異種晶核， 故細胞外相較於細胞內容易且提早形成冰晶。因為水有一種很強的溶 質排斥特性，當水結成冰時，只有非常少的溶質會存在於冰晶中，故 當細胞外冰晶逐漸形成時，剩下的溶質濃度便會增加，而溶質濃度的 增加會降低剩餘細胞外溶液的凝固溫度且會增加細胞外的滲透壓。當 進行慢速冷凍時，由於細胞外冰晶的形成造成滲透壓的增加，而導致 細胞開始脫水直到細胞內外溶液平衡。慢速冷凍所產生的高電解質濃 度會對細胞造成傷害甚至死亡，這種現象稱為溶質效應 (solute effect) 或是溶質傷害 (solute damage) [34]。另一方面，Mazur [52] 提到將紅 血球經慢速冷凍後的存活率與電解質濃度和未形成冰晶的水的比例 有關，當未形成冰晶的水的比例低於 20%，也就是說絕大部分的水都 形成冰晶，則存活率僅與其比例有關係，比例越低存活率越低。Pegg [53] 認為這是因為冰晶的形成造成細胞存在的空間變小，細胞與細 胞之間的擠壓有害於細胞之間的交互作用，而造成細胞的死亡，這種 現象稱為聚集效應 (packing effect)。慢速冷凍所導致的細胞脫水會造 成細胞的皺縮，若皺縮量大於細胞所能忍受的程度，則會損害細胞膜 導致細胞死亡 [54]。在降溫過程中，冷凍保護劑的使用可以讓電解 12.
(26) 質的濃度降低，同時減少冰晶的形成，減少細胞的過度聚集，因為冷 凍保護劑如 DMSO 和 glycerol 能夠穿透細胞膜進入細胞，亦可以避 免因細胞脫水所造成的皺縮 [34]。另一方面，Achordoguy [55] 發現 冷凍保護劑可以與細胞膜磷脂雙層的極性端結合，在冷凍過程中穩定 細胞膜避免遭受破壞。然而，慢速冷凍法依舊沒辦法避免冰晶的形成 所可能造成細胞的傷害 [56]。 細胞進行低溫冷凍時必須加入冷凍保存液，而一般冷凍保存液的 組成主要為冷凍保護劑/抗凍劑 (如 DMSO 等)，再搭配不同濃度的血 清或是含血清的培養基。細胞在冷凍過程中加入冷凍保護劑主要可以 減少冰晶的形成而避免細胞的傷害，然而，冷凍保護劑卻有細胞毒性 (cytotoxicity) 和浸入性毒性 (infusion-related toxicity) 的缺點。Fahy [57] 研究認為，DMSO 具有會改變細胞的結構 (cytoskeleton)、基因 表現 (epigenetic events) 與核蛋白質的交聯 (crosslinking of nuclear proteins) 等的細胞毒性。Davis [58] 對於自體骨髓冷凍解凍後移植病 患進行研究，發現病患會產生與 DMSO 浸入有關的副作用，包含呼 吸困難 (83%)、心跳速率降低 (98%) 和暫時性高血壓 (96%)。 Stroncek [59] 則發現絕大部分的冷凍解凍後骨髓移植病患主要會有 浸入性反應如噁心和畏寒。另一方面，冷凍保存液中或多或少都含有 血清，一般進行幹細胞增殖都是使用人類或動物 (如牛、馬) 的血清 13.
(27) 為培養基，其含有賀爾蒙、生長因子及一些生長所需的蛋白質，但是， 人類或動物血清有受愛滋病、狂牛症等病毒或不確定物質污染的疑 慮。 目前，大多數動物細胞的體外培養，都不同程度地依賴血清才能 生長增殖。然而，就細胞生物學觀點來看，因血清的成分十分複雜， 使用血清可能影響實驗結果甚至影響細胞功能表現。就道德方面來說， 動物保護意識的抬頭，抽取胎牛血液的行為容易被質疑。另一方面， 生物醫學、組織工程和幹細胞療法的進展快速，在臨床應用上，使用 複雜甚至來源不清的血清便有很大的疑慮，故使用無血清便成為未來 趨勢。. 5.4 磁性冷凍法 日本 ABI 公司發明了一個名為 CAS (Cells Alive System) 的系統， 其將磁場加入程式降溫儀中，首先應用於食品工業上，使得食物經過 冷凍解凍後依舊可以保持新鮮。西元 2004 年日本國立廣島大學創立 了牙齒銀行，首先將 CAS 應用於細胞的冷凍保存上，並證實使用磁 性程式降溫儀可以成功地將牙周韌帶細胞進行低溫冷凍保存 [29]， 之後更延伸應用於牙齒的冷凍保存上。西元 2007 年，台灣台北醫學 大學與姊妹校日本廣島大學締結技術合作的結盟，成立第二家牙齒銀 14.
(28) 行，並於西元 2008 年 9 月開始運作。Lee 等人 [30] 研究發現，將人 類牙齒經過磁性冷凍解凍後，約 73% 的牙齒可以成功培養出牙髓幹 細胞。磁性冷凍法 (magnetic cryopreservation) 的概念即為慢速冷凍 法中加入磁場的方式來進行降溫，此方法可以藉由磁場震盪水分子， 來破壞冰核分子間氫鍵的結合而達到玻璃化的冷凍保存，因此可以避 免慢速冷凍法中冰晶形成的機會，又可以減少極快速冷凍法中高濃度 冷凍保護劑的細胞毒性。. 15.
(29) 第二章 研究動機 近年來幹細胞的研究發展迅速，各種成體幹細胞的來源亦不斷地 被發掘出來，其中間葉幹細胞被認為具有多元而廣泛的可塑性，同時 可從多種組織中獲得。在牙醫學方面，人類牙髓幹細胞已能夠被成功 地分離出來，亦被證實具有間葉幹細胞的特徵與分化能力 [10]。然 而，為了能將幹細胞完整地長期保存作為未來的研究與應用，冷凍保 存方法便成為愈發重要的課題，而冷凍保存最基本的關鍵在於如何降 低冷凍過程中對於細胞所產生的傷害，不管是來自物理性的冰晶或是 化學性的高濃度抗凍劑，而使得細胞解凍後仍維持保有幹細胞原有的 活性、特徵以及分化能力。 Kaku等人 [29] 於2007年率先使用磁性程式降溫儀，成功地將牙 周韌帶細胞進行長期低溫冷凍保存，亦即利用慢速冷凍法加入磁場的 方式，避免了冰晶對於細胞的傷害，並將此結果應用於牙齒的冷凍保 存與再植上，同時，Lee等人 [30] 進一步研究亦顯示，將人類牙齒 經過磁性冷凍解凍後，約 73% 的牙齒可以成功地培養出牙髓幹細胞。 由此可知，磁性冷凍法提供了冷凍保存牙齒組織的另一個方法。由於 間葉幹細胞的來源多元且具高發展潛力，目前尚未有研究將磁性冷凍 法應用於幹細胞的冷凍保存上，因此本實驗欲進一步利用此一磁性冷 凍法探討冷凍保存幹細胞之可行性。細胞冷凍過程中必須加入冷凍保 16.
(30) 護劑來減少冰晶的形成，由於慢速冷凍法中加入磁場的方式避免了冰 晶對於細胞的傷害，而本實驗欲研究利用磁性冷凍法是否能降低傳統 慢速冷凍法所需要的冷凍保護劑濃度，甚至使用無血清培養基作為冷 凍保存液的配方，同時，探討牙髓幹細胞經磁性冷凍解凍後的活性、 特徵以及分化能力。. 17.
(31) 第三章 研究目的 本實驗研究目的乃利用磁性冷凍法來冷凍保存牙髓幹細胞 ，不僅 希望以磁性冷凍法降低冷凍保護劑的濃度，且搭配無血清的冷凍保存 液來進行幹細胞冷凍保存，希望藉由磁性冷凍法能更有效地保存牙髓 幹細胞的數量、活性、特徵表現以及分化能力。 期待經由本研究能 提供未來各種來源的間葉幹細胞另一種新的冷凍保存方法，甚至提供 未來延伸至生殖細胞冷凍保存的研究依據，並因而擴展牙齒銀行的應 用範圍 。. 18.
(32) 第四章 研究假說 細胞在冷凍過程中加入冷凍保護劑旨在避免冰晶的形成，用以避 免冰晶容易造成細胞的傷害，然而，冷凍保護劑的加入卻可能會有細 胞毒性和浸入性毒性的缺點，本研究假說為使用磁性冷凍法冷凍牙髓 幹細胞，不僅可以降低冷凍保護劑的濃度，並且搭配無血清培養基， 而可以將間葉幹細胞的質與量都能做更有效地保存。. 19.
(33) 第五章 第一節. 研究材料與方法. 牙髓間葉幹細胞初代培養與繼代. 1.1 牙髓間葉幹細胞初代培養步驟 本實驗牙齒選取的來源為台北醫學大學附設醫院就診之患者，患者 必須健康無全身系統性疾病，且患者本人或其法定代理人須在充分瞭 解相關資訊的情形下簽署牙齒捐贈同意書，所使用的牙齒為經過台北 醫學大學附設醫院臨床 (人體) 試驗委員會所許可，計畫編號為 CRC-03-09-06。本實驗所分離出的牙髓幹細胞其來源為一 28 歲女性 的右側上顎門齒。本實驗採用的牙髓間葉幹細胞是由人類牙髓組織採 用組織塊酶解法 (tissue explants -collagenase digestion method) [10]於 體外進行初代培養而來。實驗步驟如下，先以 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) 將牙齒表面沖洗乾淨，再以中藥材研磨缽敲 碎牙齒後取出牙髓組織，先將牙髓組織在 6 cm 培養皿中浸泡 α-MEM 培養基，待濕潤後移至另一 6 cm 培養皿以 15 號刀片切碎成泥狀，切 碎的組織以 0.5 ml type I collagenase (4 mg/ml) 與 0.5 ml dispase II (2 mg/ml) 之 1 ml 混合溶液浸泡，用微量吸管放入 15 ml 離心管中，在 37℃水域槽內振動反應 1 小時。反應完成後加入 9 ml α-MEM 培養基， 再以 500 g 離心五分鐘，捨棄上澄清液後將剩餘細胞以 10 ml α-MEM 培養基均勻打散並過篩 (70 μm strainer, Falcon, U.S.A)，最後置於 6 20.
(34) cm 培養皿中培養，培養皿置於含 5% CO2、37℃及 100% 濕度的細胞 培養箱中，隔日更換 α-MEM 培養基，之後培養時每三至四天更換一 次培養基。此時定義為初代 (第一代) 細胞 (圖 1)。. 1.2 牙髓間葉幹細胞繼代培養 當細胞在培養皿中繁殖達到約八分滿盤時，則進行細胞繼代培養 (subculture)，以幫助細胞繼續順利生長。實驗步驟為將細胞培養盤 中的培養基吸掉，加入 DPBS 輕輕清洗兩次然後吸掉，加入 1.5 ml 0.25% Trypsin/EDTA，放入細胞培養箱中作用五分鐘，之後顯微鏡 觀察確定細胞都已與培養皿分離，加入 6 ml PBS 稀釋，用 pipette 將 flask 中細胞液吸起來放入 15 ml 離心管中，離心後 (500 g 5 分鐘) 吸 掉上澄清液，加入 10 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布，置入 T-75 細胞培養盤中培養，之後則以 1：8 的比例進行細胞繼代培養。每次 細胞成功繼代後，依序定義為第二代、第三代…等，以此類推。. 1.3 材料與試劑 1. α-MEM 培養基： 此 α-MEM 培養基的配製為參考 Gronthos [10] 的配方，其步驟為 將可配成一公升培養基的小包裝 α-MEM (GIBCO 11900-024, U.S.A.) 粉末於燒杯中以二次水溶解，並加入 Sodium Bicarbonate 21.
(35) 2.2 g，混合均勻後 pH 值調整至 7.3，取 835 ml 之後加入 150 ml 胎 牛 血 清. (FBS) (GIBCO 26140-079, U.S.A.) 、 10 ml. Antibiotic-Antimycotic (含有 10,000 units/ml penicillin、10,000 μg/ml streptomycin 和 25 μg/ml amphotericin B) (GIBCO 15240-062, U.S.A.) 和 5 ml L-ascorbic acid 2-phosphate (Sigma 49752-10G, stock solution = 20 mM)，分別進行過濾 (0.22 μm vacuum filter)，配成一公升的 α-MEM 培養基，之後冷藏於 4℃ 冰箱中。 2. Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)： 將 DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 粉末加入二次水，配製成一 公升的溶液，再進行過濾 (0.22 μm vacuum filter)，之後冷藏於 4℃冰箱中。一公升 DPBS 包含 KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、NaCl 8.0 g 和 Na2HPO4 1.15 g。 3. Type I collagenase： 以 DPBS 將 Type I collagenase (Sigma C0130, U.S.A.) 溶解為 4 mg/ml 之溶液，並以 0.2 μm 濾網過篩，保存於-20℃。 4. Dispase II： 以 DPBS 將 Dispase II. (Sigma D4693, U.S.A.) 溶解為 2. mg/ml 之溶液，並以 0.2 μm 濾網過篩，保存於 -20℃。 22.
(36) 5. 6 cm 培養皿 6. 70 μm strainer (Falcon, U.S.A.) 7. 0.22 μm vacuum filter (CORNING, U.S.A.) 8. 0.2 μm syringe filter (CORNING, U.S.A.) 9. 0.25% Trypsin-EDTA 10X, 100 ml (GIBCO, U.S.A.) 10. T-75 Cell Culture flask (CORNING 430641). 23.
(37) 第二節. 細胞冷凍. 2.1 細胞冷凍步驟 將細胞培養盤中的培養基吸掉，加入 DPBS 輕輕 wash 三次然後吸 掉，接著加入 3 ml Accutase，放入細胞培養箱中十分鐘，用 pipette 將細胞培養盤中細胞液吸起來放入 15 ml 離心管中，離心後 (500 g 5 分鐘) 吸掉上澄清液，加入 1 ml 胎牛血清或無血清培養基，使細胞 均勻分布，利用血球計數器進行細胞計數。離心管中再加入胎牛血清 或無血清培養基進行稀釋，使離心管中的細胞密度達到 2 × 106 cells/ml，吸取 0.5 ml 細胞液置入冷凍小管中，再另外加入 0.5 ml 冷 凍保存液 (含血清冷凍保存液或無血清冷凍保存液)，使得每個冷凍 小管內的細胞固定為 1 × 106 cells/ml。然後分別利用磁性程式降溫儀 (圖 2) (磁性冷凍組) 與冷凍保存盒 (無磁性冷凍組) 進行降溫，最後 將冷凍小管置入 -150℃冰箱冷凍保存。 磁性冷凍法為將冷凍小管置入磁性降溫儀中，依照 Kaku [29] 所 設定的程式進行降溫，冷凍小管放入前應事先將降溫儀進行運轉，讓 溫度維持在 -5℃且按下 CAS 按鈕，並將指數設定為 6.0。降溫程序 設定為 -5℃維持 15 分鐘，之後以每分鐘下降 0.5℃的速率降溫至 -32℃，降溫完成後將冷凍小管直接放入 -150℃冰箱冷凍保存，經冷 凍保存一週後，再將冷凍小管解凍進行後續的分析實驗。 24.
(38) 無磁性冷凍組則是將冷凍小管置入冷凍保存盒之中，再將冷凍保 存盒放入 -80℃冰箱 [60]，隔夜後 (至少經過 12 個小時) 將冷凍小 管移入 -150℃冰箱中冷凍保存，經冷凍保存一週後，再將冷凍小管 解凍進行後續的分析實驗。 Samuelsson [61] 利用冷凍保存盒將骨髓間葉幹細胞進行降溫冷凍 (10% DMSO)，冷凍保存時間從一周至 30 個月，研究發現，解凍後細 胞存活率不受到冷凍時間長短的影響，故本實驗選擇冷凍保存的時間 為一週。另一方面，由於本實驗各組的冷凍時間皆為一致，且本實驗 的目的為比較有無磁場的差異，故冷凍保存的時間因素則不去探討。. 2.2 材料與設備 1. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 2. Accutase, 100 ml (Millipore, U.S.A.) 3. 胎牛血清 (FBS) (GIBCO 26140-079, U.S.A.) 胎牛血清使用前必須用 0.2 μm syringe filter 進行過濾 4. 無血清培養基組 (STEMPRO® MSC SFM, GIBCO A10332-01, U.S.A.) a.. STEMPRO® MSC SFM Basal Medium. b.. STEMPRO® MSC SFM Supplement. c.. 無血清培養基：75% Basal Medium + 25% Supplement. 5. 含血清冷凍保存液：胎牛血清 + DMSO 25.
(39) 6. 無血清冷凍保存液：STEMPRO® MSC SFM Basal Medium + 25% STEMPRO® MSC SFM Supplement + DMSO 7. 血球計數器 8. 冷凍小管 (Cryogenic Vial, CORNING 430659) 9. 磁性程式降溫儀 (ABI Corporation Ltd., Abiko, Japan) 10. 冷凍保存盒 (Nalgene) 11. DMSO (Dimethyl sulfoxide，Sigma). 26.
(40) 第三節. 細胞解凍. 3.1 細胞解凍步驟 將冷凍小管從 -150℃冰箱中取出，立即在 37℃水浴槽中解凍，約 兩分鐘後溶解，用 75% 酒精消毒冷凍小管表面，用 pipette 將細胞液 從冷凍小管中吸起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產生)，慢慢地加 入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)，離心後將上 澄清液吸掉，加入 α-MEM 培養基，使細胞均勻分布。. 3.2 材料與試劑 1. 75% 酒精 2. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 3. α-MEM 培養基. 27.
(41) 第四節. 細胞冷凍解凍後存活率分析. 4.1 存活率分析步驟 本實驗使用Apoptosis assay (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD PharmingenTM) 檢測細胞經冷凍解凍後的存活率。用流式細 胞技術研究細胞凋亡的技術日益廣泛，由於可以對凋亡細胞的多種特 徵進行快速、靈敏、特異的定性分析和定量分析，流式細胞技術已經 成為凋亡分析的重要檢測手段。凋亡細胞的早期變化之一，是細胞膜 上磷脂絲氨酸 (Phosphatidyl Serine) 的外露。健康的細胞膜有一不對 稱性，即磷脂絲氨酸只存在胞膜內層而不外露，此不對稱性之維持， 須借助能量ATP；而凋亡細胞的早期變化是停止產能作用，故而無法 維持此不對稱性，而使得磷脂絲氨酸外露。流式細胞儀技術可以 fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V標記失去對稱性的凋亡細 胞和壞死細胞，再配合Propidium Iodide (PI) 染色區別失去能量的凋 亡細胞 (PI－)，還是壞死細胞 (PI＋)，計算活細胞 (FITC Annexin V negative and PI negative) 所佔的比例，進而更精確地確認解凍後細胞 的存活率。細胞冷凍解凍後立即進行細胞存活率分析，其步驟為細胞 解凍後加入DPBS稀釋，然後離心去除上澄清液，立即加入1 ml Annexin V Binding Buffer 將細胞分布均勻，取100 μl 細胞液至每個 eppendorf中，實驗組於 eppendorf 中加入5 μl FITC Annexin V 和 5 28.
(42) μl PI Staining Solution，於室溫避光15分鐘，控制組則不加入FITC Annexin V 和 PI Staining Solution，15分鐘之後，每個 eppendorf 加 入 400 μl Annexin V Binding Buffer，於1個小時內進行流式細胞儀分 析。流式細胞儀操作時，以控制組來界定實驗組的象限分隔線，每個 實驗數據預設收集 5000 顆細胞，其中FITC Annexin V 與 PI 兩者表 現皆為negative的活細胞 (viable cells) 數佔 5000 顆細胞的百分比定 義為細胞存活率 (viability)，此外，FITC Annexin V positive 與 PI negative的細胞則為早期凋亡細胞 (early apoptotic cells)，而FITC Annexin V positive 與 PI positive的細 胞 則為 壞 死細胞 (necrotic cells)。. 4.2 試劑與設備 1. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD PharmingenTM) 2. Eppendorf 3. 流 式 細 胞 儀. (Guava EasyCyte Mini Base System, Guava. Technologies, Millipore). 4.3 無磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後存 活率分析 將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，其中冷凍保存液則選擇胎 29.
(43) 牛血清加上不同濃度的 DMSO (0 – 10%)，利用冷凍保存盒放入 -80℃ 冰箱進行牙髓間葉幹細胞的降溫，最後置入 -150℃冰箱中冷凍保存， 經 過 冷 凍保 存一週 後 ， 將細 胞解凍 ， 立 即利 用流式 細 胞 儀進 行 apoptosis assay，分析經過無磁性冷凍解凍後的細胞存活率。. 4.4 磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後存活 率分析 將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，其中冷凍保存液則選擇胎 牛血清加上不同濃度的 DMSO (0 - 10%)，利用磁性程式降溫儀進行 牙髓間葉幹細胞的降溫，最後置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷 凍保存一週後，將細胞解凍，立即利用流式細胞儀進行 apoptosis assay， 分析經過磁性冷凍解凍後的細胞存活率。. 4.5 使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細胞存活 率分析 實驗使用四組冷凍保存液，其中兩組為含血清的冷凍保存液，其 成分分別為「胎牛血清 + 3% DMSO」和「胎牛血清 + 10% DMSO」， 另外兩組為無血清冷凍保存液，其成分分別為「無血清培養基 + 3% DMSO」和「無血清培養基 + 10% DMSO」，四組細胞同樣經過磁性 冷凍解凍後，立即利用流式細胞儀進行 apoptosis assay，分析四組細 30.
(44) 胞之存活率。. 4.6 使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁性冷凍下 之細胞存活率分析 此實驗分為三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 於兩組冷凍組中將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，而冷凍保存液 則選擇「無血清培養基 + 3% DMSO」，分別利用冷凍保存盒和磁性 程式降溫儀進行降溫，最後置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷凍 保存一週後，將細胞解凍，立即利用流式細胞儀進行 apoptosis assay， 分析細胞經冷凍和解凍後的存活率，並與未冷凍組做分析比較。. 31.
(45) 第五節. 細胞冷凍解凍後之貼附率分析. 5.1 細胞貼附率分析 此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」 ， 降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)， 離心後將上澄清液吸掉，加入 1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布， 將細胞培養在 24-well 細胞培養盤中，每個 well 加入 5 μl 細胞液 (約 5 × 103 cells)，共放入 3 個 well。未冷凍組則在每個 well 加入約 5 × 103 cells，三組同樣經過 6 個小時之後，用 DPBS 將未貼附的細胞沖洗吸 掉，然後每個 well 加入 500 μl α-MEM 培養基，接著，利用 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay 細 胞數與反應後吸光值成正比的原則來測定不同組別的吸光值，在每個 well 中加入 50 μl MTT solution，在 37℃培養箱中反應 3 小時，吸掉 MTT solution，加入 DMSO 500 μl，稍微搖晃使結晶均勻溶解於 DMSO 中，取 100 μl 置入 96-well 內，於 30 分鐘內以 ELISA reader 在 570 nm 讀取吸光值。將無磁性冷凍組和磁性冷凍組牙髓間葉幹細胞貼附後的 MTT assay 吸光值除以未冷凍組的吸光值，計算出細胞冷凍解凍後的 32.
(46) 貼附率。. 5.2 材料與試劑 1. MTT (Sigma) 2. MTT solution (5 mg/ml in DPBS) 3. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 4. α-MEM 培養基 5. 24-well culture plate 6. 96-well culture plate 7. DMSO (Dimethyl sulfoxide，Sigma). 33.
(47) 第六節. 細胞冷凍解凍後之複製率分析. 6.1 細胞複製率分析 (細胞免疫染色) 此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」 ， 降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)， 離心後將上澄清液吸掉，加入 1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布， 三組實驗同樣將細胞培養在細胞培養玻片 (chamber slide) 上，每個 well 約種 5000 cells，經過 24 小時之後，用 DPBS 沖洗吸掉未貼附的 細胞，加入 200 μl Bromodeoxyuridine (BrdU) solution，置入細胞培養 箱中，經過 24 小時後吸除 BrdU solution，用 DPBS wash 數次，加入 70% alcohol 於 4℃ 15-30 分鐘使細胞固定，使用 distilled water wash 三次 (每次 2 分鐘)，使用 distilled water (125 μl) 1：1 稀釋 Reagent 2 (3 滴)，每個 chamber 加入 125 μl 後，作用 30 分鐘，吸除 Reagent 2，用 DPBS wash 三次 (每次 2 分鐘)，加入 Reagent 3 作用 10 分鐘，吸除 Reagent 3，不 wash，加入 Reagent 4 作用 30-60 分鐘，吸除 Reagent 4， 用 PBS wash 三次 (每次 2 分鐘)，加入 Reagent 5 作用 10 分鐘，吸除 Reagent 5，用 DPBS wash 三次 (每次 2 分鐘)。1 ml distilled water 各 34.
(48) 加 1 滴 Reagent 6A、6B 和 6C，混合均勻且避光，每個 chamber 加入 125 μl，作用 2-5 分鐘後，吸除並用 distilled water wash，接著加入 Reagent 7 作用 1-2 分鐘後，吸除並加入 DPBS 等待 30 秒直到變藍色， 使用 distilled water wash，最後加入 200 μl distilled water 於顯微鏡下 觀察照相。. 6.2 細胞複製率分析（流式細胞儀） 此實驗同樣分成三組 (如同 6.1 細胞免疫染色分組)，使用流式細 胞儀進行 BrdU assay 的量化分析，計算細胞染到 anti-BrdU antibody conjugated with phycoerythrin (PE) 佔所有細胞的比例。將細胞培養在 6-well 細胞培養盤中，每一組分別有控制組和實驗組，每個 well 約種 2 × 105 cells，經過 24 小時之後，吸除細胞培養盤中的培養基，用 DPBS 沖洗吸掉未貼附的細胞，控制組加入 α-MEM 培養基，實驗組則每個 well 加入 3 ml BrdU solution，置入細胞培養箱中，經過 24 小時培養 之後，吸除 BrdU solution，用 PBS wash 數次，用 0.25% Trypsin/EDTA 收集細胞至 15 ml 離心管，離心去除上澄清液，慢慢加入 ice cold 70% alcohol 200 μl 混合均勻，於室溫反應 20 分鐘，每一管離心管加入 1 ml wash buffer，混合均勻，離心，去除澄清液，加入 100 μl denaturing solution (2 M HCl)，混合均勻，於室溫培養 20 分鐘，加入 1 ml wash 35.
(49) buffer，混合均勻，離心，去除澄清液，加入 500 μl 0.1 M sodium borate solution，於室溫培養 2 分鐘，加入 1 ml 的 wash buffer，混合均勻， 離心，去除澄清液，每管加入 100 μl dilution buffer，控制組加入 5 μl PE Mouse IgG1κ Isotype Control，實驗組則加入 5 μl PE Mouse Anti-BrdU 於室溫培養 20 分鐘，加入 500 μl PBS 混合均勻，流式細胞儀分析。. 6.3 材料與試劑 1. Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling reagent (Invitrogen 696030A) 2. Bromodeoxyuridine (BrdU) solution： BrdU labeling reagent 以 α-MEM 培養基 1：100 稀釋，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾 3. BrdU staining kit (Invitrogen 93-3943)：Reagent 2-7 Reagent 2：Denaturing solution Reagent 3：Blocking solution Reagent 4：Biotinylated Mouse Anti-BrdU Reagent 5：Streptavidin-Peroxidase Reagent 6A：Substrate Buffer (20×) Reagent 6B：DAB Concentrate (20×) Reagent 6C：0.6% Hydrogen Peroxide Concentrate (20×) Reagent 7：Hematoxylin 36.
(50) 4. 細 胞 培 養 玻 片. (Lab-Tek II Chamber Slide, Nalge Nunc. International 154534) 5. 6-well 細胞培養盤 (Costar 3516) 6. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 7. PE Mouse Anti-BrdU Set (BD PharmingenTM 556029) a. PE Mouse IgG1κ Isotype Control b. PE Mouse Anti-BrdU 8. Washing buffer (DPBS + 0.5% BSA) 9. Denaturing solution (2 M HCl) 10. Dilution buffer (DPBS + 0.5% Tween-20 + 0.5% BSA) 11. 0.1 M sodium borate solution (Sigma, U.S.A.) 12. Ice cold 70% alcohol 13. Distilled water. 37.
(51) 第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析 7.1 間葉幹細胞之抗體 本實驗所檢測的間葉幹細胞負向標誌 (Negative marker) 包括 CD14 和 CD34，而正向標誌 (Positive marker) 包括 CD29、CD44、 CD73、CD90、CD146、CD166 和 STRO-1。. 7.2 流式細胞儀前置處理 此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 其中未冷凍組使用 DPBS 清洗細胞培養盤兩次，加入 3 ml Accutase 10 分鐘，加入 7 ml DPBS 稀釋，吸起細胞放入 15 ml 離心管中，離心 (500 g 5 分鐘) 去除上澄清液，加入 1 ml DPBS，細胞計數，加入 DPBS 稀釋成 1 × 106 cells/ml，取 100 μl 細胞液至各個 eppendorf 中。另一 方面，兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」，降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞 解凍，解凍後立即進行細胞表面標誌分析，將細胞液從冷凍小管中吸 起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產生)，慢慢地加入 9 ml DPBS， pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)，離心後將上澄清液吸掉，加 入 1 ml DPBS，將細胞混合均勻，分別取 100μl 至各個 eppendorf。每 個 eppendorf 各加 2 μl 抗體 (避光處理)，置於 4℃ 30 分鐘，加入 500 38.
(52) μl DPBS，將細胞均勻分布，進行流式細胞儀分析。. 7.3 材料與試劑 1. Accutase, 100 ml (Millipore, U.S.A.) 2. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 3. Mouse anti-CD14 Ab, PE conjugated IgG 2ak (BD PharmingenTM ) 4. Mouse anti-CD29 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 5. Mouse anti-CD34 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 6. Mouse anti-CD44 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 7. Mouse anti-CD73 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 8. Mouse anti-CD166 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 9. Mouse anti-CD90 Ab, PE conjugated IgG 1k (BD PharmingenTM ) 10. Mouse anti-CD146 Ab, PE conjugated IgG 1k 11. Mouse IgG 2ak, PE conjugated (BD PharmingenTM ) 12. Mouse IgG 1k, PE conjugated (BD PharmingenTM ) 13. Monoclonal Anti-human STRO-1 Antibody (R&D systems MAB 1038) 14. FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgM (Jackson Immuno Research 81174, U.S.A.). 39.
(53) 第八節. 細胞冷凍解凍後之分化分析. 8.1 脂肪分化步驟 此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」 ， 降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)， 離心後將上澄清液吸掉，加入 1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布， 三組實驗組同樣將細胞種在 96-well 細胞培養盤中，每一組分別有控 制組和實驗組兩組，控制組包含 3 個 well，實驗組包含 3 個 well，每 個 well 種約 1 × 104 細胞，經過約 3-4 天後，當細胞達到滿盤時，小 心吸除培養基，控制組每個 well 加入 200 μl 脂分化控制組培養基， 實 驗 組 每 個 well 加 入 200 μl 脂 分 化 誘 導 培 養 基 (adipogenesis induction medium)，每 3 至 4 天換一次，每次每個 well 吸掉 100 μl 加 入 100 μl 新的脂分化誘導培養基或脂分化控制組培養基，經過 21 天 誘導分化後，吸除脂分化誘導培養基或脂分化控制組培養基，加入 200 μl DPBS 小心清洗，吸除 DPBS 後，加入 4% paraformaldehyde 200 μl 於室溫 15 分鐘進行細胞固定，吸除 paraformaldehyde，加入 200 μl 60% isopropanol 清洗，吸除 isopropanol 後加入 Oil red O working 40.
(54) solution 100 μl 於室溫 10 分鐘，吸除 Oil red O solution，用 distilled water rinse 三次，加入 100 μl 50% glycerol 於顯微鏡觀察拍照。拍照結束後 進行脂分化量化 [62]，吸除 glycerol，用 distilled water rinse 三次，每 個 well 加入 isopropyl alcohol 100 μl，以 ELISA reader 在 540 nm 檢測 吸光值。. 8.2 骨分化步驟 此實驗分成三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組， 兩組冷凍組所使用的冷凍保存液皆為「無血清培養基 + 3% DMSO」 ， 降溫後皆置於 -150℃ 冰箱，經過一週冷凍保存後將細胞解凍，解凍 後，將細胞液從冷凍小管中吸起置入 15 ml 離心管 (盡量避免氣泡產 生)，慢慢地加入 9 ml DPBS，pipette 均勻後進行離心 (500 g 5 分鐘)， 離心後將上澄清液吸掉，加入 1 ml α-MEM 培養基，使細胞均勻分布， 三組實驗組同樣將細胞種在 24-well 細胞培養盤中，每一組分別有控 制組和實驗組兩組，控制組包含 3 個 well，實驗組包含 3 個 well，每 個 well 種約 5 × 104 細胞，經過約 3-4 天後，當細胞達到滿盤時，小 心吸除培養基，控制組每個 well 加入 2 ml α-MEM 培養基，實驗組每 個 well 加入 2 ml 骨分化誘導培養基 (osteogenesis induction medium)， 每 3 至 4 天換一次，每次每個 well 吸掉 1 ml 加入 1 ml 新的 α-MEM 41.
(55) 培養基或骨分化誘導培養基，經過 21 天誘導分化後，吸除骨分化誘 導培養基，每個 well 加入 500 μl DPBS 小心清洗，吸除 DPBS 後，加 入 4% paraformaldehyde 200 μl 於室溫 15 分鐘進行細胞固定，吸除 paraformaldehyde，用 distilled water rinse 兩次 (每次 5-10 分鐘)，利用 alizarin red S 染色法確認骨化細胞鈣沈積，每個 well 加入 alizarin red S 200 μl 於室溫 20 分鐘，吸除 alizarin red S，用 distilled water rinse 四 次，加入 1 ml distilled water 顯微鏡觀察拍照。拍照結束後進行鈣沈 積量化分析 [63]，每個 well 加入 300 μl 10% (v/v) acetic acid，室溫下 incubation with shaking 30 分鐘，將細胞刮下 (包含 acetic acid) 轉移 至 1.5 ml 離心小管，Vortex 30 秒，加熱至 85℃ 10 分鐘 (注意避免蓋 子被打開)，轉移至冰上 5 分鐘，離心 15000 g 15 分鐘，吸取 250 μl 上澄清液放入新的 1.5 ml 離心小管，加入 100 μl 10% ammonium hydroxide 中和，吸取等量 100 μl 放入 96-well 細胞培養盤中，以 ELISA reader 在 405 nm 檢測吸光值。 不論是在脂分化或是骨分化實驗中，都是在細胞貼附細胞培養盤 且培養 3-4 天後，待細胞生長複製至滿盤時，才加入誘導培養基進行 誘導分化。細胞培養盤中每個 well 面積一定，能夠佔據的細胞數目 一定，故待細胞滿盤後，不同組別的細胞數會相同，故可排除起始培 養盤中細胞數不同的問題。 42.
(56) 8.3 材料與試劑 1. α-MEM 培養基 2. 脂分化控制組培養基 (α-MEM 培養基 + 0.3% DMSO) 3. 脂分化誘導培養基： a. α-MEM 培養基 b. 500 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) c. 60 μM indomethacin d. 0.5 μM hydrocortisone e. 10 μg/ml insulin Stock solution. 作用濃度. α-MEM 培養基. 500 ml 498 ml. 500 mM IBMX in DMSO. 500 μM. 500 μl. 60 mM indomethacin in DMSO. 60 μM. 500 μl. 0.5 mM hydrocortisone in DMSO. 0.5 μM. 500 μl. 10 mg/ml insulin. 10 μg/ml. 500 μl. 4. 4% paraformaldehyde in DPBS 5. DPBS (Sigma D5652, U.S.A.) 6. 100% and 60% isopropanol 7. Oil red O stock solution： 43.
(57) 取 oil red O 粉末 (Sigma O-0625) 0.14 g 溶於 40 ml 100% isopropanol 中，stir overnight，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾， 儲存於 4℃中。 8. Oil red O working solution： 取 0.6 ml oil red O stock solution + 0.4 ml distilled water，置於室溫 20 分鐘，用 0.2 μm syringe filter 進行過濾，於使用前才進行配製。 9. Distilled water 10. 10% ammonium hydroxide 11. 10% (v/v) acetic acid 12. 1.5 ml 離心小管 13. 骨分化誘導培養基： a.. α-MEM 培養基. b. 0.01 μM Dexamethasone solution c.. 1.8 mM Glycerol 2-phosphate solution. Stock solution. 作用濃度. α-MEM 培養基. 500 ml 499 ml. 1 mM Dexamethasone solution. 0.01 μM. 5 μl. 0.9 M Glycerol 2-phosphate solution. 1.8 mM. 1 ml. 44.
(58) 14. 2% Alizarin red S solution： 取 0.8 g Alizarin red S 加 35 ml distilled water，以 NaOH 調至 pH=4.2， 加 distilled water 至 40 ml，儲存於室溫。. 45.
(59) 第九節. 統計分析. 本實驗中的分析值皆運用統計學來判別不同組別是否具有差異， 所有的測定和觀察均進行三重複實驗且進行三次獨立實驗，實驗結果 的數據則以平均值 ± 標準差 (SD) 表示。其中，比較不同組別的存 活率、貼附率、複製率、表面標誌的表現率以及分化量化吸光值，是 以 one-way ANOVA 和 Scheffe (Post Hoc檢定) 檢定法進行比較，以 p 值< 0.05 表示有統計學上的差異，而同一DMSO濃度下比較無磁性 冷凍組與磁性冷凍組的存活率，以及同一冷凍組別下有或無誘導分化 的比較，則是以 Student’s t test 進行比較，以 p 值< 0.05表示有統計 學上的差異。. 46.
(60) 第六章. 實驗結果. 第一節 無磁性冷凍下使用不同 DMSO 濃度之細胞存活率分析 此實驗為牙髓間葉幹細胞使用胎牛血清搭配不同濃度 DMSO 作為 冷凍保存液，利用冷凍保存盒放入 -80℃ 冰箱進行牙髓間葉幹細胞 的降溫，最後置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷凍保存一週後， 將細胞解凍，立即利用流式細胞儀進行 apoptosis assay，分析解凍後 細胞存活率，其結果發現使用不同 DMSO 濃度的冷凍保存液其平均 細胞存活率如圖 3 所示，10% DMSO 組平均細胞存活率為 (61.0 ± 0.5)%，未冷凍控制組平均細胞存活率為 (84.9 ± 2.7)%，兩者相差約 20%，隨著 DMSO 濃度下降，平均細胞存活率也隨之降低，經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，10 % DMSO 組的細胞存活率與未冷凍控制組、0%、1%、2%、3% DMSO 各組之間有顯著性差異 (p < 0.05) (圖 3)。. 47.
(61) 第二節 磁性冷凍下使用不同 DMSO 濃度之細胞存活率分析 此實驗為牙髓間葉幹細胞使用胎牛血清搭配不同濃度DMSO作為 冷凍保存液，利用磁性程式降溫儀進行牙髓間葉幹細胞的降溫，最後 置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷凍保存一週後，將細胞解凍， 立即利用流式細胞儀進行apoptosis assay，分析解凍後細胞存活率， 其結果發現使用不同DMSO濃度的冷凍保存液其平均細胞存活率如 圖4所示，10% DMSO組平均細胞存活率為 (74.8 ± 3.8)%，未冷凍控 制組其平均細胞存活率為 (84.9 ± 2.7)%，兩者相差約10%，經過 one-way ANOVA 和 Scheffe法 (Post Hoc檢定) 檢定後發現，10% DMSO組的細胞存活率與未冷凍控制組、0%、1%、2% DMSO各組之 間有顯著性差異 (p < 0.05) (圖4)。將圖3和圖4合併分析，在各個 DMSO 濃 度 下 比 較 無 磁 性 冷 凍 法 與 磁 性 冷 凍 法 的 存 活 率 ， 使 用 Student’s t 檢定，結果發現 2% DMSO至10% DMSO各組中磁性冷凍 細胞存活率顯著高於無磁性冷凍 (p < 0.05) (圖5)。. 48.
(62) 第三節 使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細胞 存活率分析 此實驗分別使用四組不同的冷凍保存液，將牙髓間葉幹細胞同樣 經過磁性冷凍法冷凍解凍後，立即利用流式細胞儀進行 apoptosis assay，分析四組之細胞存活率。結果發現，其平均細胞存活率分別 為， 「胎牛血清 + 3% DMSO 組」為 (71.8 ± 3.4)%， 「胎牛血清 + 10% DMSO 組」為 (74.4 ± 3.4)%， 「無血清培養基 + 3% DMSO」為 (76.2 ± 4.8)%，「無血清培養基 + 10% DMSO」為 (78.7 ± 7.1)%，經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，這四組 之間的平均細胞存活率沒有顯著性差異 (圖 6)。. 49.
(63) 第四節 使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁性冷 凍下之細胞存活率分析 此實驗選擇使用「無血清培養基 + 3% DMSO」作為冷凍保存液， 將牙髓間葉幹細胞分別經過無磁性和磁性冷凍法進行細胞冷凍保存， 經 過 冷 凍保 存一週 後 ， 將細 胞解凍 ， 立 即利 用流式 細 胞 儀進 行 apoptosis assay，分析解凍後細胞存活率，結果發現，無磁性冷凍組 其平均細胞存活率為 (57.4 ± 1.5)%，磁性冷凍組平均細胞存活率為 (76.2 ± 4.8)%，而未冷凍控制組平均細胞存活率為 (84.9 ± 2.7) %。經 過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，未冷 凍控制組平均細胞存活率顯著高於無磁性冷凍組和磁性冷凍組 (p < 0.05)，而磁性冷凍組平均細胞存活率顯著高於無磁性冷凍組 (p < 0.05) (圖 7)。. 50.
(64) 第五節 細胞冷凍解凍後之貼附率分析 此實驗為觀察細胞經不同冷凍方法冷凍解凍後的貼附能力。牙髓 間葉幹細胞經過冷凍解凍後將細胞種在細胞培養盤上，經過六個小時， 用 DPBS 沖洗掉未貼附的細胞，之後利用 MTT assay 觀察吸光值。將 未冷凍的牙髓間葉幹細胞貼附後的 MTT assay 吸光值當做 1，經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發現，牙髓幹 細胞經磁性冷凍解凍後的平均貼附率 ((53.3 ± 7.6)%) 顯著高於無磁 性冷凍組的平均貼附率 ((39.4 ± 1.1)%) (p < 0.05) (如圖 8 所示)。. 51.
(65) 第六節 細胞冷凍解凍後之複製率分析 此實驗利用 BrdU assay 觀察比較牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方法 冷凍解凍後的複製率，分別藉由免疫細胞染色觀察和流式細胞儀量化 檢測。免疫細胞染色結果顯示，不論是未冷凍組、無磁性冷凍組和磁 性冷凍組在顯微鏡下面皆可以觀察到有細胞的細胞核呈現深褐色，這 代表此細胞有被 Biotinylated monoclonal anti-BrdU 抗體所染到，也就 是此細胞為新生成的細胞，而未被抗體所染到的細胞，其細胞核因被 hemotoxylin 染色而呈現淡藍色 (圖 9)。另一方面，使用 PE Mouse Anti-BrdU 抗體進行細胞免疫染色，再經由流式細胞儀進行量化分析， 結果發現被染到抗體的細胞佔所有細胞的比例，其平均值未冷凍組為 (73.4 ± 0.9)%，無磁性冷凍組為 (41.9 ± 5.4)%，磁性冷凍組為 (74.1 ± 4.7)%。經過 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 檢定後發 現，無磁性冷凍組的平均複製率顯著低於未冷凍組和磁性冷凍組 (p < 0.05)，而磁性冷凍組與未冷凍組之間的複製率沒有顯著性差異 (圖 10)。. 52.
(66) 第七節 細胞冷凍解凍後之表面標誌 (surface marker) 分析 本實驗利用流式細胞儀分析比較牙髓間葉幹細胞經不同冷凍方法 冷凍解凍後的表面標誌表現量。本實驗所檢測的間葉幹細胞負向標誌 (Negative marker) 包括 CD14 和 CD34，而正向標誌 (Positive marker) 包括 CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD166 和 STRO-1。牙 髓間葉幹細胞利用流式細胞儀進行表面標誌的分析 (圖 11-13)，各個 標誌在不同組別的表現量結果如列表所示 (表 1)，各組之間表現量的 比較則使用 one-way ANOVA 和 Scheffe 法 (Post Hoc 檢定) 進行檢定。 其中結果發現負向標誌 CD14 和 CD34 不論在未冷凍組、無磁性冷凍 組和磁性冷凍組平均表現量都低於 1%，而且三組平均表現量沒有顯 著性差異 (圖 14)。正向標誌 CD29、CD44 和 STRO-1 不論在未冷凍 組、無磁性冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量三組之間沒有顯著性差 異 (圖 15)。正向標誌 CD73、CD146 和 CD166 在未冷凍組的平均表 現量顯著高於無磁性冷凍組和磁性冷凍組 (p < 0.05)，而磁性冷凍組 在這三者抗體的平均表現量顯著高於無磁性冷凍組 (p < 0.05) (圖 16)。 正向標誌 CD90 在未冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量皆顯著高於無 磁性冷凍組 (p < 0.05)，而未冷凍組和磁性冷凍組的平均表現量，兩 者之間沒有顯著性差異。. 53.
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