第五章 研究材料與方法
第四節 細胞冷凍解凍後存活率分析
本實驗使用Apoptosis assay (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD PharmingenTM) 檢測細胞經冷凍解凍後的存活率。用流式細 胞技術研究細胞凋亡的技術日益廣泛，由於可以對凋亡細胞的多種特 徵進行快速、靈敏、特異的定性分析和定量分析，流式細胞技術已經 成為凋亡分析的重要檢測手段。凋亡細胞的早期變化之一，是細胞膜 上磷脂絲氨酸 (Phosphatidyl Serine) 的外露。健康的細胞膜有一不對 稱性，即磷脂絲氨酸只存在胞膜內層而不外露，此不對稱性之維持，
須借助能量ATP；而凋亡細胞的早期變化是停止產能作用，故而無法 維持此不對稱性，而使得磷脂絲氨酸外露。流式細胞儀技術可以 fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V標記失去對稱性的凋亡細 胞和壞死細胞，再配合Propidium Iodide (PI) 染色區別失去能量的凋 亡細胞 (PI－)，還是壞死細胞 (PI＋)，計算活細胞 (FITC Annexin V negative and PI negative) 所佔的比例，進而更精確地確認解凍後細胞 的存活率。細胞冷凍解凍後立即進行細胞存活率分析，其步驟為細胞 解凍後加入DPBS稀釋，然後離心去除上澄清液，立即加入1 ml Annexin V Binding Buffer 將細胞分布均勻，取100 μl 細胞液至每個 eppendorf中，實驗組於 eppendorf 中加入5 μl FITC Annexin V 和 5
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μl PI Staining Solution，於室溫避光15分鐘，控制組則不加入FITC Annexin V 和 PI Staining Solution，15分鐘之後，每個 eppendorf 加 入 400 μl Annexin V Binding Buffer，於1個小時內進行流式細胞儀分 析。流式細胞儀操作時，以控制組來界定實驗組的象限分隔線，每個 實驗數據預設收集 5000 顆細胞，其中FITC Annexin V 與 PI 兩者表 現皆為negative的活細胞 (viable cells) 數佔 5000 顆細胞的百分比定 義為細胞存活率 (viability)，此外，FITC Annexin V positive 與 PI negative的細胞則為早期凋亡細胞 (early apoptotic cells)，而FITC Annexin V positive 與 PI positive的細胞則為壞死細胞 (necrotic cells)。
4.2 試劑與設備
1. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD PharmingenTM) 2. Eppendorf
3. 流 式 細 胞 儀 (Guava EasyCyte Mini Base System, Guava Technologies, Millipore)
4.3 無磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後存 活率分析
將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，其中冷凍保存液則選擇胎
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牛血清加上不同濃度的DMSO (0 – 10%)，利用冷凍保存盒放入 -80℃
冰箱進行牙髓間葉幹細胞的降溫，最後置入 -150℃冰箱中冷凍保存，
經 過 冷 凍保 存一週 後 ， 將細 胞解凍 ， 立 即利 用流式 細 胞 儀進 行 apoptosis assay，分析經過無磁性冷凍解凍後的細胞存活率。
4.4 磁性冷凍下不同 DMSO 濃度對牙髓間葉幹細胞冷凍解凍後存活 率分析
將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，其中冷凍保存液則選擇胎 牛血清加上不同濃度的DMSO (0 - 10%)，利用磁性程式降溫儀進行 牙髓間葉幹細胞的降溫，最後置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷 凍保存一週後，將細胞解凍，立即利用流式細胞儀進行apoptosis assay，
分析經過磁性冷凍解凍後的細胞存活率。
4.5 使用 DMSO 冷凍保存液含有或無血清在磁性冷凍下之細胞存活 率分析
實驗使用四組冷凍保存液，其中兩組為含血清的冷凍保存液，其 成分分別為「胎牛血清 + 3% DMSO」和「胎牛血清 + 10% DMSO」，
另外兩組為無血清冷凍保存液，其成分分別為「無血清培養基 + 3%
DMSO」和「無血清培養基 + 10% DMSO」，四組細胞同樣經過磁性 冷凍解凍後，立即利用流式細胞儀進行apoptosis assay，分析四組細
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胞之存活率。
4.6 使用無血清冷凍保存液 (含 3% DMSO) 經過有或無磁性冷凍下 之細胞存活率分析
此實驗分為三組，分別為未冷凍組、無磁性冷凍組與磁性冷凍組，
於兩組冷凍組中將牙髓間葉幹細胞加入冷凍保存液中，而冷凍保存液 則選擇「無血清培養基 + 3% DMSO」，分別利用冷凍保存盒和磁性 程式降溫儀進行降溫，最後置入 -150℃ 冰箱中冷凍保存，經過冷凍 保存一週後，將細胞解凍，立即利用流式細胞儀進行apoptosis assay，
分析細胞經冷凍和解凍後的存活率，並與未冷凍組做分析比較。
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第五節 細胞冷凍解凍後之貼附率分析