動物氣喘模式試驗

1. 實驗動物

6 週大 BALB/c 小鼠 購自國家實驗動物中心 (Taiwan) 2. 化學藥品

(1) OVA (ovalbumin)、BSA、Hanks’ balanced salts (HBSS)、NaCl、Na2HPO4、 NaH2PO4、NH4Cl、trypan blue、avertin (2,2,2-tribromoethanol)、tert-amyl alcohol、

Carbonate/bicarbonate capsule 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA) (2) IFN-γ 及 IL-4 ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)

(3) IL-5 及 IL-13 ELISA kit 購自 eBioscience Inc. (CA, USA)

(4) IgE 及 IgG2a ELISA kit 購自 BD Pharmingen. (Bioscience, San Diego, USA) (5) Tween-20、KHCO₃ 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)

(6) 福馬林 10% Formaldehyde solution 購自 Mallinckrot Baker Inc. (Phillipsburg., USA)

(7) Liu stain A、Liu stain B 由臺灣大學醫學檢驗暨生物技術學系之莊雅惠副教授 之實驗室提供 (Taiwan)

(8) 佐 劑 Aluminum hydroxide (Alum.) 購 自 Thermo Fisher Scientific Inc.

(Rockford, USA) 3. 試劑

(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO₄、1.5 mM KH2PO₄ 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2 - 7.4 後即可使用。

33

(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。

(3) RBC lysis buffer：秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。

(4) OVA solution：將 OVA 粉末以 PBS 配成 5 mg/mL 後，再以 0.2 µm 膜過濾，

分裝並保存於 -20℃ 冰箱。

(5) Avertin working solution：先將 3.1 mL tert-amyl alcohol + 5 g avertin，於棕色 血清瓶在室溫下攪拌 12 小時使其完全溶解後，以 0.2 µm 膜過濾，分裝於 棕色 eppendorf 並保存於室溫。，取 0.5 mL 並加入 39.5 mL PBS 於棕色血 清瓶在室溫下攪拌 12 小時後，以 0.2 µm 膜過濾，並保存於 4℃ 冰箱。

(6) IgE 及 IgG2a coating buffer：將 carbonate/bicarbonate 回溶於 100 mL DI，過 0.2 µm 膜並保存於 4℃ 冰箱。

4. 儀器設備及器材 (1) 細胞培養箱 Hera cell

(2) 細胞離心機 Shandon cytospin cytocentrifuge 購自 Thermo Fisher Scientific Inc.

(USA)

(3) ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc. (USA) (4) 0.1 mm deep 細胞計數器 購自 Reichert Inc. (NY, USA)

(5) 1 mL 針、軟針 購自 Terumo (Tokyo, Japan)

(6) 半體積 96 孔平底盤 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA) (7) 5 mm 小鼠臉頰採血針 購自 MEDpoint, Inc. (Miami, USA)

[方法]

2.4.1 小鼠致敏步驟 (圖十一)

小鼠至少分為未致敏之 PBS 組、致敏之 OVA 組及 sample 組，一組共 5 隻。先將小鼠以打耳洞方式編號成 1-5 號、採血，並於 Day 0、7、14 及 21 以

34

腹腔注射之方式打入 OVA (OVA 組及 sample 組) 或 PBS (PBS 組)，每隻鼠打 200 µL。配藥方面，OVA 及 sample 組 Day 0 的一隻鼠配藥劑量為 50 µg OVA (10 µL) + 2 mg Alum. (50 µL) + PBS 140 µL，Day 7、14、21 則為 25 µg OVA (5 µL) + 2 mg Alum. (50 µL) + PBS 145 µL；Day 0、7、14、21 之 PBS 組則為 2 mg Alum.

(50 µL) + PBS 150 µL。Day 28 及 29 進行 challenge，先以 avertin working solution 麻醉小鼠 (500 µL/隻) 後，用鼻腔注射 (intranasal, i.n.) 之方式將 OVA 滴入每組小鼠，一隻鼠的藥劑配方為 100 µg OVA (20 µL) + PBS (20 µL)，Day 30 犧牲小鼠並進行下一步實驗。

2.4.2 小鼠餵食方式

小鼠於致敏後 Day 14-Day27 進行餵食步驟 (Lee et al., 2013)，每一隻小鼠於 早上 10-12 點之間餵食，一次餵 200 µL/隻，每隻小鼠約 0.02 kg，本次之茯苓 蛋白 PCP 餵食餵食劑量分別為 50 µg、100 µg 及 200 µg/day (每天餵食 2.5、5 及 10 mg/kg)，故 PCP 蛋白液需先調成 250 µg/mL、500 µg/mL 及 1 mg/mL。

2.4.3 支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 取得方式

小鼠於 Day 30 採血後以斷頸方式犧牲，用針固定前掌及口部後，從喉部以 剪刀及鑷子剪開外皮，撥開左右兩邊肉後可見白色氣管，以鑷子將氣管上的膜撥 開。先以軟+硬針吸 1 mL HBSS 插入氣管約 2 mm，抽出硬針並來回推拉針筒三 次後吸出 0.6 mL BALF 於 eppendorf 得到液 1，之後再以 1 mL HBSS+1%BSA 注入氣管並抽 0.6 mL BALF 兩次，得到液 2、液 3。將液 1 及液 2 離心 6000 rpm、3 分鐘後，吸取液 1 之上清作為 ELISA 測試用 BALF 並存放於 -20℃ 冰 箱 (因 BSA 會影響 ELISA 結果)，液 2 上清倒掉，液 3 之細胞液則與前兩管 混合後，離心 6000 rpm、3 分鐘並加入 200 µL RBC lysis buffer，2 分鐘後加入 800µL PBS 停止反應，離心後加入 500 µL HBSS+1%BSA 進行細胞計數。

35

2.4.4 劉氏細胞染色 (Liu stain)

BALF 細胞計數後，調成 5×10⁵-1×10⁶ cells/mL，取 200 µL 打 cytospin 450 rpm、4 分鐘後，以蠟筆圈出玻片上之細胞團塊，於水槽邊先用滴管滴一滴 Lius stain A 於細胞團塊上，30 秒後再滴兩滴 Lius stain B，90 秒後以自來水洗淨背 景，並在顯微鏡下觀察、計算巨噬細胞、嗜酸性球及嗜鹼性球之數量，每一片至 少共數 200 顆細胞。

2.4.5 IL-4、IL-5、IL-13 及 IFN-γ 細胞素之 ELISA 測定

所有抗體皆於 ELISA kit 中，IL-4 及 IFN-γ 為 R&D 生產，IL-5 及 IL-13 則為 eBioscience 生產。於半體積 96-well plate 加入 50 µL/well capture antibody。

R&D 以 PBS 稀釋並置於室溫下 overnight，eBioscience 則以 coating buffer 稀 釋並放於 4℃ 冰箱 overnight。隔天倒掉上清，先以 ELISA washing buffer 150 µL/well 清洗 well 5 次，再加入 blocking buffer 100 µL/well，於室溫下放 1 小時，

一樣以 ELISA washing buffer 洗 5 次，倒乾並加入 sample 與稀釋之標準品 50 µL/well，於室溫放 2 小時後清洗 5 次並加入稀釋 180 倍之 detection antibody 50 µL/well，R&D 放 2 小時，eBioscience 則放 1 小時，清洗 5 次再加入已稀 釋之 HRP 50 µL/well，R&D 放 20 分鐘，eBioscience 則放 30 分鐘，之後清洗 8 次、倒乾液體並加入 TMB solution 50 µL/well，等濃度最高之標準品呈明顯天 藍色後，以 20 µL/well 1 M H2SO4 停止反應。

2.4.6 血液之取得及 OVA 特異性 IgE、OVA 特異性 IgG2a 之測定

小鼠於 Day 0 及 Day 30 犧牲前，使用採血針進行臉頰採血，針頭插入處約 在臉頰無毛處往後 2 mm，收集血液至 eppendorf。血液於室溫下放置 3 小時，

使血液凝結、血清分層後，小心取上層血清至另一管 eppendorf，離心 6000 rpm、

3 分鐘後，再將上層之無色血清吸至 eppendorf 中，保存於 -20℃ 冰箱。

36

OVA 以 coating buffer 稀釋成 50 µg/mL 後，於半體積 96-well plate 加入 50 µL/well，放置在 4℃ 冰箱中 overnight。隔天倒掉上清，先以 ELISA washing buffer 150 µL/well 清洗 well 5 次，再加入 blocking buffer (1% BSA in PBS) 100 µL/well，於室溫下放 1 小時後，一樣以 ELISA washing buffer 洗 5 次，倒乾並 加入已稀釋 100 倍之血清 50 µL/well，於室溫放 2 小時後清洗 5 次並加入稀釋 後之 Biotin anti-mouse IgE 及 IgG2a 作為 detection antibody，50 µL/well 放 2 小時，清洗 5 次再加入稀釋 200 倍之 HRP 50 µL/well，放 30 分鐘並清洗 8 次、

倒乾液體並加入 TMB solution 50 µL/well 使液體反應至深藍色後，以 20 µL/well 1 M H2SO4 停止反應。

2.4.7 肺部切片之取得及染色

小鼠於犧牲後並抽取 BALF 後，以彎頭剪刀及鑷子剪開小鼠胸、腰部中間 的外皮，剪開膜後看見小鼠肋骨，用鑷子夾入小鼠肋骨下方之劍突，往上提並用 剪刀剪開肋骨與肺部之間的皮膜，拉出小鼠肺葉並剪離鼠體，以 PBS 清洗後放 於組織切片保存盒中，並泡於棕色血清瓶內之福馬林中。其後委託台灣大學實驗 動物中心 (Laboratory Animal Center of National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwan) 進 行 小 鼠 肺 部 之 蠟 包 埋 、 切 片 及 H & E 染 色 (hematoxylin and eosin stain)。