茯苓蛋白與樹突細胞之培養與樹突細胞活化 T 細胞能力試驗…

2.3 茯苓蛋白與樹突細胞之培養與樹突細胞活化 T 細胞能力試驗 [材料]

1. 實驗動物

(1) 4 週大之 BALB/c 及 8-12 週大之 DO11.10 小鼠 購自國家實驗動物中心 (Taiwan)

(2) TLR2^-/- 及 TLR4^-/- 受 器 缺 陷 小 鼠 購 自 The Jackson Laboratory (Maine, U.S.A)

2. 化學藥品

(1) KCl、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4Cl、Dipotassium phosphate (K2HPO4)、

trypan blue、BSA、Concanavalin A (ConA) 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)

(2) KHCO3、H2SO4、Tween-20購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) (3) IFN-γ 及 IL-4 ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)

(4) IL-6 ELISA kit 購自 eBioscience Inc. (CA, USA) (5) RPMI medium 購自 Hyclon (Utah, USA)

(6) Gentamycin、Kenamycin 購自 Amresco (Solon, OH, USA) (7) FBS 購自 GIBCO-BRL Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)

(8) 95% 酒精 ethanol 購自友和貿易股份有限公司 (New Taipei City, Taiwan) (9) PE/Cy5-conjugated CD11c、CD4；FITC-conjugated CD40、CD80、CD86；

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PerCP/Cy5.5-conjugated CD11c 之 小 鼠 表 面 分 子 特 異 性 抗 體 購 自 eBioscience (San Diego, CA, USA)

(10) FITC-conjugated CD80 小鼠表面分子特異性抗體 購自 Biolegned Inc. (CA, USA)

(11) LPS-EK Ultrapure、Pam3CSK4 購自 InvivoGen (San Diego, CA, USA)

(12) CellTrace^TM CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) kit 購自 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)

(13) NaN3 購自 Riedel-deHaën® (Seelze, Germany) (14) OVA323-339 peptide 購自 Anaspec Inc. (CA, USA)

(15) Recombinant murine GM-CSF 購自 PeproTech Inc. (NJ, USA) 3. 試劑

(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2 - 7.4 後即可使用。

(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。

(3) FACS 鞘液：取 75.2 g K2HPO4、13.2 g NaH2PO4、72 g NaCl，以 DI 溶解並 加至 1 L，配製 10 倍濃的鞘液。使用前以 DI 稀釋至 1 倍，並以 0.2 µm 濾 膜過濾。

(4) FACS buffer：於 1 倍之 FACS 鞘液中加入 2 % FBS、0.1 % (w/w) NaN3 溶 解混勻後，以鞘液加至 500 mL，並以 0.22 µm 濾膜過濾，保存於 4 °C 冰 箱中。

(5) RBC lysis buffer : 秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。

(6) 細胞培養液：將 10% FBS、0.1% 10mg/mL Gentamycin、0.1% 10mg/mL Kenamycin 加入 RPMI-1640 medium。

4. 儀器設備及器材

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(1) 細胞培養箱 Hera cell

(2) 離心機 Labofuge 購自 Heraeus group

(3) ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc. (USA) (4) 流式細胞儀 FACScan、流式細胞儀上樣管 Falcon tube 購自 BD Biosciences

(San Jose, CA, USA)

(5) 多孔細胞培養盤 cell culture plate、50 mL 及 15 mL 離心管 centrifuge tube、6 cm dish、20 µm 無菌濾網 cell strainer 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)

(6) 0.1 mm deep 細胞計數器 購自 Reichert Inc. (NY, USA)

(7) 旋渦式震盪器 Vortex-Genie2 購自 Sientific Industries (Bohemia, NY, USA) (8) 1 mL 針購自 Terumo (Tokyo, Japan)

(9) 0.22 µm Minisart 濾膜 購自 Sartorious (Goettingen, Germany) (10) 96 孔 V 底盤 96-well V plate 購自 Nunc (Rochester, NY, USA)

(11) 半體積 96 孔平底盤 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)

[方法]

2.3.1 骨髓衍生樹突細胞之取得方式

將四週大之小鼠以二氧化碳犧牲後，全身噴酒精殺菌消毒並放入無菌操作台 之鋁箔紙上，以剪刀及鑷子剪開小鼠腹部中央之毛皮，沿著小鼠腰部撕開外皮後，

先將一隻腳的外皮以剪刀及鑷子輔助脫除並連同鼠掌一同剪下，再以另一組乾淨 剪刀及鑷子剪下連同髖部下方關節之鼠腿，以確保其骨髓細胞未流失，將鼠腿以 棉花清除上面的皮毛後泡於 PBS 中清洗血水。以第三組剪刀及鑷子將腿部之肉 剪除，剩下的碎肉則可用紗布磨下，磨乾淨之腿骨浸泡於酒精中 5 分鐘，再以乾 淨的 PBS 洗淨腿骨。

將腿骨由關節處扭斷使骨髓露出，把用來去除細胞雜塊的濾膜放到 50 mL

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離心管上，並使用 1 mL 針吸滿 medium，插入骨髓洞口，將骨髓細胞沖入離心 管中離心 1500 rpm、8 分鐘，去除上清液並刮散細胞後，加入 500 µL RBC lysis buffer 反應 30 秒，再加入 4.5 mL PBS 停止反應，離心 1500 rpm、4 分鐘後去 除上清液並刮散細胞，加入 3 mL medium 即可計數細胞。

2.3.2 茯苓蛋白與樹突細胞之培養

取得樹突細胞後，將其濃度調成 2×10⁶ cells/mL，並加 1 mL 於 6-well plate 中，再加入以 medium 稀釋之 GM-CSF (500 unit/mL)，1 mL/well，於 37℃ 之 培養箱中培養 7-14 天，每隔 3 天換一次含 GM-CSF 的 medium，使骨髓細胞 能衍生成未成熟之樹突細胞。樹突細胞衍生完成後，將細胞濃度調成 2×10⁶ cells/mL、LPS 及 PCP 濃度調成兩倍後，加入細胞培養盤中培養 24 小時，隔天 即可收集上清液並進行下一步實驗。

2.3.3 樹突細胞與 DO11.10 CD90.2⁺ T 細胞之培養

將已培養 7-14 天之樹突細胞或預先以 OVA 及 LPS、PCP 培養好之樹突細 胞與分選好之 DO11.10 CD90.2⁺ T 細胞分別配成 1.8×10⁶ cells/mL 及 1.8×10⁷ cells/mL (DC:T=1:10) 以利 T 細胞增生 (Höpken et al., 2005)，分別取 50 µL/well 加入 48-well plate，再將 OVA (10 µg/mL) 加入，100 µL/well，使最終 OVA 濃度 為 5 µg/mL。另以 ConA (5 µg/mL) 做為活化 T 細胞之正控制組測試。

2.3.4 樹突細胞之表面分子檢測

將培養好之細胞收至 eppendorf，離心 2000 rpm、3 分鐘後收取細胞上清液，

加入所需體積之 FACS buffer 並混勻細胞後，下細胞至 96-well V 盤 (1×10⁵ in 100 µL FACS buffer/well)。離心 2000 rpm、3 分鐘後倒乾上清並以 vortex 震散細 胞，重複此清洗步驟 2 次。於避光條件下加入 1 µL/well PE-conjugated CD11c 抗

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體染樹突細胞及 FITC-conjugated C40/CD80/CD86 抗體染欲觀察之表面分子，並 加入 100 µL/well FACS buffer，包鋁箔紙避光並放入 4℃ 冰箱，40 分鐘後依照 上面之清洗步驟於避光條件下洗 3 次，用 pipetman 混勻 100 µL 細胞後過篩加 入 falcon tube，再加入 500 µL FACS buffer，置冰並使用流式細胞儀 FACScan 測 平均螢光強度 (mean fluorescent intensity, MFI) 及與對照組之差異百分比。

2.3.5 CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) 細胞增生試驗

由於細胞染 CFSE 後，於細胞分裂的增生過程中會使每顆細胞所含的螢光量 減少，故可藉由螢光減少的程度來判定細胞是否有增生情形。將分好之 CD90.2⁺ T 細胞以 PBS 調成 5×10⁶ cells/mL，以下步驟全部於避光條件下進行。加入 0.4 µL/mL 之 FITC-conjugated CFSE 於細胞液後，於 37℃ 之細胞培養箱中放 8 分 鐘，使 CFSE 與細胞結合，再離心 1500 rpm、4 分鐘，倒去上清液後加入 1 mL FBS 反應 2 分鐘以去除多餘染劑。離心 1500 rpm、4 分鐘後，加入 5 mL RPMI medium 離心洗兩次後，方可計數細胞並與蛋白共培養 72 小時，使用 FACScan 測差異值變化。

2.3.6 IL-4、IL-6 及 IFN-γ 細胞素之 ELISA 酵素免疫分析法測定

所有抗體皆於 ELISA kit 中，IL-4 及 IFN-γ 為 R&D 生產，IL-6 則為 eBioscience 生產。於半體積 96-well plate 加入 50 µL/well capture antibody。R&D 之抗體以 PBS 稀釋並置於室溫下 overnight，eBioscience 則以 coating buffer 稀 釋並放於 4℃ 冰箱 overnight。隔天倒掉上清，先以 ELISA washing buffer 150 µL/well 清洗 well 5 次，再加入 blocking buffer 100 µL/well，於室溫下放 1 小時，

一樣以 ELISA washing buffer 洗 5 次，倒乾並加入 sample 細胞上清液與稀釋之 標 準 品 50 µL/well ， 於 室 溫 放 2 小 時 後 清 洗 5 次 並 加 入 稀 釋 180 倍 之 detection antibody 50 µL/well，R&D 放 2 小時，eBioscience 則放 1 小時，清洗

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5 次再加入已稀釋之 HRP 50 µL/well，R&D 放 20 分鐘，eBioscience 則放 30 分鐘，清洗 8 次後倒乾液體並加入 TMB solution 50 µL/well，等濃度最高之標準 品呈明顯天藍色後，以 20 µL/well 1 M H2SO4 停止反應。

2.4 動物氣喘模式試驗