國立台灣大學生物資源學系暨農學院 園藝暨景觀學研究所
碩士論文
Department of Horticulture and Landscape Architecture College of Bio-Resources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
茯苓免疫調節蛋白活化樹突細胞及調節 T
H1 免 疫反應
Poria cocos Immunomodulatory Protein Induces TH1 Immune Response by Activated Dendritic Cells
紀柏羽 Po-Yu Chi
指導教授：許輔 博士 Advisor: Fuu Sheu, Ph.D.
中華民國 103 年 7 月
July, 2014
I
國立臺灣大學碩士學位論文
口試委員會審定書
II
致謝
首先要感謝的是許輔老師，老師提供了金費、資源及相當好的實驗環境供我 們研究生進行各種試驗，並教導我們如何審論文、做研究生報告，除此之外也時 常叮嚀我們注意如何規劃時間、自我約束和團隊合作，使我們的研究生能力及人 生中的處事能力大有進展。也由衷感謝周志輝老師、潘敏雄老師及繆希椿老師撥 空修改論文及參加口試，使這份碩士畢業論文能變得更完整。
而在研究生生活中，感謝淑幸助理姊姊在我們的研究室生活中常常提供好吃 的餐飲、點心，以及璨哥的幫助，讓我們就算在忙碌的試驗期也能夠安心、愉快 的度過。感謝雅婷及千育學姐當我的實驗啟蒙者，讓我的實驗能力進步! 感謝志 良學長及小白學姊在做試驗、進度報告及投影片上的諸多專業指導，以及佳琳、
映柔、偉齊、英誌、沛樺、香萍、思辰及伊如準備口試之場佈及餐點，也一起感 謝幫大家修改論文的所有室友們! 此外也要謝謝慧欣學姊詳細的研究資料，以及 美如、育靈學姊的論文格式和試驗相關資訊，幫助我完成論文。
謝謝一路陪伴我度過重重難關的同屆同伴們-季霖、瑜珊、雅玲和宛真，在實 驗室的各種活動如中秋烤肉、尾牙及室遊等，或是在學校事務中各種紙本文件的 填表繳交上，都能發揮絕佳團隊精神來完成它，也很高興我們終於順利畢業了!
十分感謝我的家人，不但提供了金費使我能有念研究所的機會，也在我遇到 實驗挫折等人生低潮期的時候在身旁陪伴。最後也感謝所有給予過我幫助的人們，
誠摯的獻上我的感謝之意!
紀柏羽 謹誌於 國立臺灣大學園藝暨景觀學研究所 中華民國一百零三年七月二十四日
III
中文摘要
茯苓蛋白 PCP (Poria cocos protein) 為由茯苓菌核萃取出的蛋白二聚體，分 子量為 35.6 kDa，包含 14.3 kDa 單元及 21.3 kDa 含醣基單元。PCP 具有活化 RAW264.7 巨噬細胞及小鼠腹腔巨噬細胞的能力，在 anti-CD3/CD28 mAbs 存在 的 環 境 與 T 細 胞 共 同 培 養 可 活 化 T 細 胞 並 分 泌 TH1 細 胞 素 IFN-γ (interferon-gamma)，且於異位性皮膚炎之貼膚試驗中可抑制 TH2 免疫反應。因為 PCP 無法直接活化 CD90.2+ T 細胞，故本研究推測 PCP 必須利用脾細胞中的抗 原呈現細胞 (antigen-presenting cells, APCs)，如樹突細胞 (dendritic cells, DCs) 使 輔助型 T 細胞分化成 TH1 型，並設計試驗驗證之。首先，在探討 PCP 是否能 活化 DCs 的研究中，PCP (100 µg/mL) 可增加小鼠 DCs 之 CD40、CD80 及 CD86 表 現及 IL-6 及 IL-12p70 分 泌 量， 證 明 PCP 可 活化 DCs 。 由 TLR (toll-like receptor) 2-/- 及 TLR4-/- 基因剔除鼠之 DCs 表面分子表現及 IL-6 細胞 素分泌試驗結果推測 PCP 不完全透過 TLR2 或 TLR4 路徑活化 DCs。接著，
在探討樹突細胞調節 TH 免疫反應之試驗中，預先與 PCP 及 OVA 抗原培養過 的 DCs 可增加對 OVA 有特異性之 DO11.10 CD90.2+ T 細胞增生及分泌 IFN-γ，
並減少 IL-4 分泌量，顯示 PCP 有助於 DCs 呈現 OVA 並使免疫反應導向 TH1。
最後，於 OVA 誘導之小鼠氣喘試驗中，餵食 PCP (100 µg/day) 可增加支氣管肺 泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) IFN-γ 濃度及血清 OVA-specific IgG2a 含量，並降低 BALF 嗜酸性球 (eosinophils) 數、TH2 細胞素 (IL-4、IL-5、
IL-13) 濃度、血清 OVA-specific IgE 含量及肺部組織的發炎細胞浸潤情形。由以 上試驗結果證明 PCP 可透過活化樹突細胞使 TH1 型細胞分化，並抑制 TH2 型 細胞分化，減少動物氣喘模式之小鼠 TH2 免疫反應。
關鍵字：茯苓、免疫調節蛋白、樹突細胞、輔助型 T 細胞、呼吸道過敏
IV
Abstract
Poria cocos protein (PCP), which is purified from dried sclerotium of Poria cocos, is a 35.6 kDa heterodimer protein including 14.3 and 21.3 kDa glycosyl subunits. In our previous results, PCP could active RAW264.7 cells and mouse peritoneal macrophages. This protein could also up-regulate murine T cells to secrete IFN-γ in the presence of anti-CD3/CD28 mAbs and inhibit TH2 immune-response in patch test for atopic dermatitis. However, PCP could not directly activate the differentiation of CD90.2+ T cells to TH1 cells, suggesting antigen-presenting cells as dendritic cells (DCs) could be responsible for the activation of PCP on TH1 cells.
In this study, we first found that PCP could up-regulate the expression of CD40, CD80, and CD86 and induce secretion of IL-6 and IL-12p70 on murine DCs. In the results of PCP incubated with DCs of TLR2-/- and TLR4-/- mice, we found that PCP might induce DCs activation through neither TLR2 nor TLR4 pathway. Second, PCP significantly increased the antigen-presentimg ability of murine DCs to promote cell proliferation and IFN-γ secretion of OVA-specific DO11.10 CD90.2+ T cells.
Meanwhile, these DCs could inhibit the OVA-specific IL-4 secretion by DO11.10 CD90.2+ T cells. According to the results, we suggested that PCP can help DCs presenting antigen and skewing immune-response to TH1. Finally, in OVA-induced asthma mouse model, oral administration of PCP (100 µg/day) could increase the production of IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and OVA-specific IgG2a in serum. Oral administration of PCP could also down-regulate the amount of eosinophils and TH2 cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13) in BALF, OVA-specific IgE in serum, and cell infiltration in mouse lung sections. In conclusion, PCP can activate DCs to promote differentiation of TH1 cells and suppress TH2 immune-response in mouse model of asthma.
V
Keywords: Poria cocos; immunomodulatory protein; bone marrow-derived dendritic cell; T helper cell; allergic airway inflammation
VI
總目錄
口試委員會審定書………..I 致謝……….II 中文摘要………....III Abstract...………...…IV 總目錄.………...…...VI 圖目錄………...……..X 縮寫對照表………...XI
第一章 緒論………...1
1.1 茯苓之前人研究………1
1.1.1 簡介……….………1
1.1.2 茯苓之生長與栽種……….………1
1.1.3 茯苓之成分……….2
1.1.3.1 多醣類………...2
1.1.3.2 三萜類……….…………..3
1.1.4 茯苓之生物活性……….………3
1.1.4.1 抗腫瘤活性………...3
1.1.4.2 抗發炎………...4
1.1.4.3 抗氧化………...5
1.1.4.4 抗菌………...5
1.1.4.5 降血糖………...5
1.1.4.6 腎保護作用………...6
1.2 茯苓蛋白之研究………7
1.2.1 茯苓蛋白 PCP 之生化特性……….………..7
VII
1.2.2 茯苓蛋白 PCP 之生物活性……….…………..7
1.2.2.1 PCP 於 APCs 之影響……….………..7
1.2.2.2 PCP 於 T 細胞之影響……….……….8
1.3 樹突細胞………9
1.3.1 樹突細胞簡介……….………….9
1.3.2 樹突細胞之活化………10
1.3.3 樹突細胞之表面分子………10
1.3.4 樹突細胞活化路徑………10
1.3.5 樹突細胞分泌之細胞素及功能………11
1.4 輔助型 T 細胞………...11
1.4.1 輔助型 T 細胞之活化……….11
1.4.2 TH1 型及 TH2 型輔助 T 細胞簡介………..……….12
1.5 過敏性氣喘與 TH 免疫反應之相關性……….13
1.5.1 過敏反應介紹………...13
1.5.2 過敏反應之免疫發生步驟………13
1.5.3 過敏性氣喘簡介………....14
1.5.4 如何透過調控 TH 免疫反應抑制過敏反應………...15
1.6 研究動機與目的………...15
第二章 材料與方法……….………17
2.1 茯苓蛋白之萃取與分子量檢測………..17
2.1.1 茯苓蛋白粗萃取………...17
2.1.2 DE-52 管柱層析………...18
2.1.3 蛋白去醣試驗………...20
2.1.4 SDS 電泳………..20
2.1.5 PAS 醣蛋白染色………..22
VIII
2.2 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養與免疫活性試驗………23
2.2.1 脾細胞之取得………...25
2.2.2 由脾細胞中分離 CD90.2+ T 細胞………..25
2.2.3 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養………26
2.2.4 MTT 細胞活性試驗……….26
2.2.5 ELISA 酵素免疫分析法測定 IFN-γ………..26
2.3 茯苓蛋白與樹突細胞之培養與樹突細胞活化 T 細胞能力試驗…..…….27
2.3.1 骨髓衍生樹突細胞之取得方式………...29
2.3.2 茯苓蛋白與樹突細胞之培養………...30
2.3.3 樹突細胞與 DO11.10 CD90.2+ T 細胞之培養………..30
2.3.4 樹突細胞之表面分子檢測……….…..30
2.3.5 CFSE 細胞增生試驗………31
2.3.6 IL-4、IL-6 及 IFN-γ 細胞素之 ELISA 酵素免疫分析法測定...31
2.4 動物氣喘模式試驗………..32
2.4.1 小鼠致敏步驟……….………..33
2.4.2 小鼠餵食方式………...34
2.4.3 支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 取得方式……….….34
2.4.4 劉氏細胞染色……….…..35
2.4.5 IL-4、IL-5、IL-13 及 IFN-γ 細胞素之 ELISA 測定…………..35
2.4.6 血液之取得及 OVA 特異性 IgE、OVA 特異性 IgG2a 之測定..35
2.4.7 肺部切片之取得及染色………...36
2.5 統計方式………..…36
第三章 結果……….………37
3.1 PCP 無法直接活化 T 細胞…………...……….……37
3.1.1 PCP 之製備……….………..…37
IX
3.1.2 PCP 無法直接活化 CD90.2+ T 細胞……….………...…37
3.2 PCP 可活化樹突細胞………...38
3.2.1 PCP 可促進 DC 表面分子之表現………..…...39
3.2.2 PCP 提高樹突細胞分泌 IL-6 及 IL-12p70……….….39
3.3 PCP-DC 抑制 DO11.10 T 細胞之 TH2 免疫反應……….…….40
3.3.1 T 細胞之 CFSE 細胞增生試驗結果………..40
3.3.2 細胞上清液 IFN-γ 及 IL-4 濃度測定結果……….40
3.4 PCP 活化 DC 之路徑研究………..…….41
3.4.1.1 PCP 刺激 TLR2-/- 小鼠樹突細胞……….……42
3.4.1.2 PCP 刺激 TLR4-/- 小鼠樹突細胞……….……42
3.5 餵食 PCP 於動物氣喘模式試驗……….43
3.5.1 BALF 嗜酸性球及 TH2 細胞素……….43
3.5.2 BALF TH1 細胞素………...………...44
3.5.3 血清 OVA-specific-IgE 及 OVA-specific-IgG2a………...44
3.5.4 肺部切片 H&E 染色結果………....………...45
第四章 討論………...46
4.1 PCP 活化樹突細胞之討論及其與 TLR4 路徑之相關性...46
4.2 PCP 透過活化樹突細胞誘導 TH1 反應...47
4.3 餵食 PCP 於小鼠氣喘動物模式之討論...48
4.4 結論………...50
第五章 參考文獻……….51
附圖………60
X
圖目錄
圖一、PCP 之 DE-52 層析、SDS-PAGE 及 PAS 醣染分析結果。………..60 圖二、PCP 與脾細胞及 CD90.2+ T 細胞培養後之細胞活性。………61 圖三、PCP 刺激 BALB/c 脾細胞及 CD90.2+ T 細胞 IFN-γ 分泌之活性。……62 圖四、PCP 可增加 BALB/c BMDCs 表面分子 CD40、CD80 及 CD86 表現 量。………..63 圖五、PCP 活化之 BMDCs 可提升 IL-6 及 IL-12p70 分泌結果。…………...64 圖六、PCP 預培養之 BMDCs 可促 DO11.10 T 細胞增生。……….65 圖七、DO11.10 T 細胞與 PCP 預培養之 BMDCs 培養後 IFN-γ 及 IL-4 分泌 量。 ………...……….66 圖八、與 PCP 共培養之 TLR2-/- BMDCs 表面分子 CD40、CD80 及 CD86 表 現。 ……….……..….………67 圖九、與 PCP 共培養之 TLR4-/- BMDCs 表面分子 CD40、CD80 及 CD86 表 現。 ……….………...68 圖十、與 PCP 共培養之 TLR2-/- 及 TLR4-/- 樹突細胞 IL-6 分泌量。…………...69 圖十一、動物氣喘模式之試驗步驟。………...70 圖十二、餵食 PCP 可降低 BALB/c 小鼠 BALF 之嗜酸性球數。……...71 圖十三、口服 PCP 之氣喘小鼠 BALF TH2 細胞素 IL-4、IL-5 及 IL-13 分 泌。………...………...72 圖十四、口服 PCP 氣喘小鼠 BALF 之 TH1 細胞素 IFN-γ 分泌。…………..…73 圖十五、口服 PCP 氣喘小鼠血清之 OVA 特異性 IgE 及 IgG2a 分泌。…………...74 圖十六、H&E 染色之小鼠肺部切片。……….75
XI
Alum APC BALF BMDC CD CFSE ConA DC DE-52 DI water DMSO EDTA ELISA FITC FPLC H&E stain HBSS IFN-γ Ig IL LPS mAb MACS
縮寫對照表
aluminum hydroxide antigen-presenting cell bronchoalveolar lavage fluid bone marrow-derived dendritic cell cluster of differentiation
carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester concanavalin A
dendritic cell
diethylaminoethyl cellulose distilled water
dimethyl sulfate
ethylenediaminetetraacetic acid enzyme-linked immunosorbent assay fluorescein isothiocyanate
fast protein liquid chromatography hematoxylin and eosin stain Hanks’ balanced salts interferon-gamma immunoglobulin interleukin
lipopolysaccharide monoclonal antibody
magnetic-activated cell sorting
XII
MFI MTT OVA Pam3CSK4 PAS
PBS PCP PE RBC RPMI SDS-PAGE TH cell TLR TNF
mean fluorescent intensity
(3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl) tetrazolium salt Ovalbumin
Pam3CysSerLys4
periodic acid-Schiff’s stain phosphate buffered saline Poria cocos proteins phycoerythrin red blood cell
Roswell Park Memorial Institutemedium
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis T helper cell
toll-like receptor tumor necrosis factor
1
第一章 緒論
1.1 茯苓之前人研究 1.1.1 茯苓簡介
茯苓 [Poria cocos (Schw.) Wolf]，又名茯靈、茯兔、玉靈、松薯、松苓、松柏 芋或萬靈桂，為真菌界 (Fungi) 擔子菌門 (Dikarya) 傘菌綱 (Agaricomycetes) 多 孔 菌 目 (Polyporales) 多 孔 菌 科 (Polyporaceae) 臥 孔 菌 屬 茯 苓 種 之 乾 燥 菌 核 (sclerotium)，其菌核呈球形或不規則塊狀，表皮呈粗瘤狀皺縮、淡灰棕色或黑褐 色，內部則為白色或粉色，而易與之混淆的菝葜科植物土茯苓，其外皮則為黃棕 色或黑褐色。產地多分布於中國大陸雲南、河南、山東、安徽、浙江、福建、廣 東、廣西、湖南、湖北等地 (張等，2008)。
茯苓屬於藥食兩用的藥材，在《神農本草經》中，茯苓被列為上品，其性平、
味甘淡，歸心、脾、肺、腎經，具有利水滲濕、健脾胃、寧心安神之作用 (Ríos, 2011)，
適用於水腫尿少、脾虛、消化不良、食慾不振、心神不安、失眠多夢、口焦舌乾 者，尤以對婦女及老年人之滋補效果最佳，近年的研究也證明茯苓中富含的茯苓 多糖可增強人體免疫功能，提升抗病能力 (張等，2008；趙與林，2004)。市面上 常見的產品則有茯苓餅、茯苓糕及茯苓粉等，常見的茯苓料理則為四神湯及茯苓 蓮子粥 (張等，2008)。
1.1.2 茯苓之生長與栽種
根據《本草經》、《淮南子》及《本草圖經》之記載，野生茯苓多季生於排水 良好、乾燥向陽山地的松科植物根部，例如馬尾松或赤松。而在《藝文類聚》及
《抱朴子》兩書中也提到，野生之茯苓常與菟絲共生，因此生有茯苓之松科植物 底部土壤面上通常可見有白色菌絲，此特徵為藥農尋找野生茯苓的明顯標誌 (王，
2011)。
2
野生茯苓一般在 7 月到次年 3 月間進入成熟期，而人工栽種之茯苓一般約栽 種 8-10 個月後採收 (楊，2013)。藥農通常使用段木及松針栽培茯苓，栽種後若 窖面土出現龜裂紋，表示已有茯苓於此生長，黑翅白蟻則是常見的茯苓蟲害。茯 苓成熟指標則可藉由以土填表面裂縫來觀察，若經過一段時間不再裂縫，即可扒 開土面觀察菌核表皮是否粗糙並呈黃褐色或棕褐色，並在未出現白色裂紋時即可 採收，通常選擇晴天挖出茯苓，去除表面泥土後蓋稻草並放於室內使茯苓脫水，
等外皮有皺紋後削皮乾燥而得 (傅等，2002；楊，2013)。
1.1.3 茯苓之成分
經現代科學分析，茯苓的植物化學成分 (phytochemical compounds) 包含多醣 類 (polysaccharides)、三萜類 (triterpenoids)、固醇類 (steroids)、胺基酸 (amino acids)、膽鹼 (choline)、組氨酸 (histidine)、及鉀鹽 (potassium chloride) 等 (Ríos, 2011; Sun, 2014)，主要成分則包含多醣類，例如 β-茯苓聚糖 (β-pachyman)，以及 三 萜 類 ， 例 如 栓 菌 酸 (trametenolic acid) 、 塊 苓 酸 (tumulosic acid) 、 齒 孔 酸 (eburicoic acid)、松苓酸 (pinicolic acid) 及乙醯茯苓酸 (pachymic acid) (Ríos, 2011)。其中多醣類能增加免疫系統刺激物的分泌，並減少免疫抑制分子的產生而 刺激免疫反應 (Sun, 2014)，而三萜類則有抑制類風濕性關節炎 (rheumatoid arthritis)、牛皮癬 (psoriasis)、自體免疫性葡萄膜炎 (autoimmune uveitis)、膿毒性 休克 (septic shock) 以及支氣管過敏 (bronchial asthma) 的能力 (Ríos, 2011)。
1.1.3.1 多醣類
從 茯 苓 分 出 的 多 糖 結 構 包 括 β- 糖 苷 鍵 (glycosidic linkage) 、 甘 露 聚 糖 (mannan) 、 α-(1→3)-D- 葡 聚 糖 (glucan) 、 β-(1→3)-D- 葡 聚 糖 或 (1→6)-branched-(1→3)-α-D-半乳聚糖 (galactan) (Sun, 2014)。在 1970 年時，
Chihara 等人便已從茯苓菌絲體中分離出含 β-(1→3)-線性葡聚糖、具有抗腫瘤活
3
性之茯苓多醣，其 MW 約為 1×106 (Chihara et al., 1970)。Wang 等人 (2004) 從 茯苓菌核中分離出 6 種多醣，其中以主鏈 (1→3)-β-吡喃葡萄糖 (glucopyranose) 及支鏈 (1→3)-β-D-葡聚醣構成的 β-茯苓聚糖為主，佔乾重 85.4-93% (Wang et al., 2010)，其餘也含有 D-葡萄糖 (D-glucose)、D-甘露糖 (D-mannose)、D-岩藻糖 (D-fucose) 等雜多醣 (heteropolysaccharides) (Wang et al., 1995)。茯苓多醣類的生 理活性研究相當廣泛，可抗氧化、抗發炎、抗菌、增強體液免疫、細胞免疫或非 特異性免疫，並可於動物試驗中發揮抗腫瘤的作用 (Sun, 2014)。
1.1.3.2 三萜類
茯苓三萜類多為非環狀之碳 30 前驅體 (acyclic 30-carbon precursors) (Xu et al., 2005)。Tai 等人於茯苓菌核表皮中分離出茯苓酸 (poricoic acid) A、茯苓酸 B、
羊毛固醇型 (lanostane) 及 3,4-開羊毛固醇型 (secolanostane) 之三萜類化合物 (Tai et al., 1993; Tai et al., 1995a)。Akihisa 等人更於 2007 年在茯苓菌核表皮中分 離出 35 種化合物，其中還包含了 15 種新發現的茯苓三萜類，包含 6 個以羊毛 固醇型為主的三萜酸類。這些茯苓三萜類能使抗腫瘤活性增加 (Akihisa et al., 2007)，並有抗催吐等作用 (Tai et al., 1995b)。
1.1.4 茯苓之生物活性 1.1.4.1 抗腫瘤活性
茯苓萃取物抑制腫瘤細胞的研究相當廣泛。在多醣類的部分，由茯苓菌絲體 中萃取、主成分為 (1→3)-(1→6)-β-D-葡聚醣的茯苓多醣，可抑制人類前骨髓性血 癌細胞 HL-60 增生 (Chihara et al., 1970)。不論是體外試驗 (in vitro) 或腹腔注射 (intraperitoneally, i.p.) 的體內試驗 (in vivo) 中，皆有抑制肝癌細胞 HepG2 的抗 癌活性 (Jin et al., 2003)。Huang 等人則是發現茯苓菌絲體的水溶性磷酸化
4
(1→3)-α-D-葡聚醣可抑制肉瘤細胞 Sarcoma 180 及肝癌細胞 HepG2 的增生，並 使 HepG2 細胞凋亡 (Huang et al., 2006；Huang and Zhang, 2011)。
在 三 萜 類 的 部 分 ， 由 茯 苓 菌 核 皮 層 萃 取 之 25- 甲 氧 基 茯 苓 酸 A (25-methoxyporicoic acid A) 可抑制 淋巴 瘤 細胞 (Raji cells) 中 人類皰 疹病毒 (Epstein-Barr virus) 早期抗原活化，在體內試驗也可抑制皮膚癌腫瘤細胞的生長 (Akihisa et al., 2009)。乙醯茯苓酸則是透過磷酸化 Bcl-2 及活化 caspases-9 和 caspases-3 使得前列腺癌細胞粒線體產生功能障礙，讓前列腺素和蛋白激酶 B (protein kinase B, PKB) 的合成受抑制而造成癌細胞凋亡 (Gapter et al., 2005)。茯 苓開羊毛固醇型的三萜類則可抑制肺癌細胞 A549 及前列腺癌細胞 DU145 之 增 生 (Zhou et al., 2008) 。 茯 苓 三 萜 類 萃 取 物 也 可 透 過 下 調 金 屬 蛋 白 酶 -7 (metalloproteinase-7) 之作用以抑制胰臟癌細胞系 Panc-1、MiaPaca-2、AsPc-1 及 BxPc-3 的增生 (Cheng et al., 2013)。
1.1.4.2 抗發炎
茯苓的抗發炎成分多為三萜類，研究指出使用乙醇萃取之茯苓菌核粉可透過 抑制 NF-κB 之路徑以減少受 LPS (lipopolysaccharide) 刺激之 Raw 264.7 巨噬 細胞產生 NO、prostaglandin E2 (PGE2)、IL-1β 及 TNF-α (tumor necrosis factor-α)，
抑制發炎反應 (Jeong et al., 2014)。Lu 等人由茯苓菌絲體多糖中分離出對內皮細 胞 (endothelial cells) 無毒性的水溶性 (1→6) 支鏈 (1→3)-a-D-半乳糖，其以劑量 效應趨勢抑制 IFN-γ 的產生，減少發炎反應，而對癌細胞的細胞毒性或抗血管生 成活性則無影響 (Lu et al., 2010)。Fuchs 等人由茯苓菌核中以甲醇萃出包含塊苓 酸、開羊毛固醇及茯苓酸之三萜類萃取物，並將此萃取物塗抹於皮膚炎患者進行 人體試驗，以為期 4 天的反覆測試後，發現此茯苓萃取物可減少患者皮膚發炎反 應強度 (Fuchs et al., 2006)。
5
1.1.4.3 抗氧化
由茯苓菌核中以不同濃度的過氧化氫 (dihydrogen dioxide, H2O2) 萃取之三 種雜多醣具有可清除烴基自由基、ABTS 自由基與鐵離子的活性，且可防止 DNA 受到 UV 輻照及雙氧水的破壞 (Tang et al., 2014)。以熱水或乙醇萃取之茯苓萃取 物則皆有 DPPH 自由基清除能力 (Lee et al., 2010)。茯苓中的 (1→3)-β-D-葡聚醣 (glucan) 氧化後，其水溶性會提升，並可增加體外試驗之自由基清除活性 (radical scavenging activity) (Wang et al., 2010)。茯苓水萃物 (Poria cocos water extract, PCW) 5-125 µg/mL 則可抑制與 20 µM β-澱粉狀蛋白 (amyloid) 培養 48 小時而 造成的 PC12 細胞氧化壓力，證明 PCW 具有抗細胞凋亡 (antiapoptotic) 之功能，
達到保護細胞的目標 (Park et al., 2009)。
1.1.4.4 抗菌
茯苓菌絲萃取物可抑制四種格蘭氏陽性菌 (gram-positive bacteria) 金黃色葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 、 表 皮 葡 萄 球 菌 (S. epidermidis) ， 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 及鏈球菌 (S. faccalis) 之生長 (Lee et al., 1982)。而將茯苓之乙 醇萃取物與煙麴黴 (Aspergillus fumigatus)、白色念珠菌 (Candida albicans)、鮑氏 不動桿菌 (Acinetobacter baumannii)、綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 及金黃 色葡萄球菌培養後，發現茯苓乙醇萃取物有抑制以上菌種之活性 (Zhang et al., 2013)。證明茯苓具有抑制細菌及真菌生長的能力。
1.1.4.5 降血糖
於體外試驗中，分別使用茯苓熱水萃取物、乙醇萃取物及超音波萃取物進行 酵素抑制試驗，發現茯苓的熱水萃取物及超音波萃取物具有較好的 α-葡萄糖苷酶 (glucosidase) 抑制作用，乙醇萃取物則可抑制 α-澱粉酶 (amylase) 之活性 (Lee et al., 2010)。用第二型糖尿病小鼠 (db/db mice) 餵食 50 mg/kg 茯苓三萜類粗萃取
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物，發現其餐後血糖值 (postprandial blood glucose) 明顯降低，而後並以生物活性 導向分離法 (bioactivity-directed fractionation and isolation, BDFI) 測定不同氯仿 (chloroform) 分餾成分之抗高血糖效能，發現脫氫塊苓酸比脫氫栓菌酸及乙醯茯 苓酸具有更好的抗高血糖能力，但此三萜類萃取物無法活化 PPAR-γ 路徑 (Li et al., 2011)。於松苓新酸 (dehydrotrametenolic acid) 餵食第二型糖尿病小鼠的研究 中，則發現茯苓新酸可透過增加胰島素之敏感性使小鼠之餐後血糖值下降，且此 刺激路徑也不屬於 PPAR-γ 路徑，故茯苓之三萜類萃取物能透過非 PPAR-γ 之路 徑增強胰島素敏感性，以減少餐後血糖值 (Sato et al., 2002)。
1.1.4.6 腎保護作用
茯苓菌核水萃物 WPC 與小鼠腎集合管上皮細胞 IMCD-3 培養之體外試驗 中，可減少細胞的高滲透壓力及水通道蛋白 Aquaporin-2 (AQP2) 之 mRNA 表現 量，提升張力應答增強結合蛋白 (Tonicity-responsive enhancer binding protein, TonEBP) mRNA 的表現，以減緩腎細胞受高滲透壓影響而死亡的情形 (Lee et al., 2012)。餵食茯苓多醣給腎發炎之大鼠 10 天後，發現其可降低尿蛋白排泄量以及 血清膽固醇之上升情形，並使血清補體 (serum complement) CH50 下降，於腎小 球 (glomeruli) 之病理組織切片中也可觀察到餵食茯苓多醣能減少腎小囊中的細 胞黏附情形，故茯苓多醣具有抗原始型腎發炎之活性 (Hattori et al., 1992)。餵食 200 mg/kg 茯苓菌核皮層之乙醇萃取物 FLP (Fu-Ling-Pi) 則可透過降低體內排尿 量及腎重指標、提升血細胞比容 (hematocrit) 來抑制腺嘌呤誘導的慢性腎臟病 (Zhao et al., 2013b) 。 以 UPLC Q-TOF/HSMS (quadrupole time-of-flight high-sensitivity mass spectrometry) 及 MSE (mass spectrometryElevated Energy
) 則可知 乙醇萃取物 FLP 透過參與脂肪酸代謝、磷脂代謝、嘌呤代謝及色胺酸代謝等主 要代謝途徑，來增強腎保護作用，預防早期腎損傷 (Zhao et al., 2013a)。
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1.2 茯苓蛋白之前人研究 1.2.1 茯苓蛋白 PCP 之生化特性
本實驗室之張慧欣學姊經由硫酸銨蛋白沉澱、透析、DEAE-52 陰離子交換管 柱及 FPLC (fast protein liquid chromatography) 層析，由茯苓菌核中萃取出茯苓免 疫調節蛋白蛋白 PCP (Poria cocos protein)，跑 native-PAGE 電泳及 FPLC 後觀 察到一波峰，由蛋白通過 FPLC 管柱的時間推測 PCP 分子量約 35.6 kDa，而以 SDS-PAGE 電泳分析及醣蛋白染色則可知 PCP 包含分子量為 21.3 kDa 之醣蛋 白單元及 14.3 kDa 之蛋白單元。由 21.3 kDa 及 14.3 kDa 蛋白片段之胺基酸組 成比例結果則可得知兩蛋白單元之胺基酸組成相似 (張，2009；Chang and Sheu, 2009)，推測其蛋白組成應為同一蛋白，而由螢光染色法可得知茯苓蛋白 PCP 存 在於茯苓菌絲的細胞壁、細胞膜及細胞核部位中 (張，2005)。
在 PCP 的基因選殖上，呂雅婷學姊利用 PCP 的 N 端胺基酸序列合成 PCP 之引子，並利用 rapid amplification cDNA end (RACE) 方法選殖出長約 807 bp、
open read frame (ORF) 為 579 bp 之 cDNA，選殖的基因序列轉譯出的胺基酸片 段約為 194 個，分子量為 12.765 kDa，且以軟體推測醣化形式與位置預測後，
得知其胺基酸序列於第 142 個位置可能具有 N-glycosylation 之修飾作用。將序 列 轉 至 大 腸 桿 菌 株 製 成 (His)6-PCP 重 組 蛋 白 ， 並 以 張 慧 欣 學 姊 所 做 出 的 anti-PCP 單株抗體進行西方轉漬法分析，預估此重組蛋白大小約 17-26 kDa (呂，
2011；Lu et al., 2014)。
1.2.2 茯苓蛋白 PCP 之生物活性 1.2.2.1 PCP 於 APCs 之影響
在張慧欣學姊過去的研究中，發現茯苓免疫調節蛋白 PCP 可活化 RAW 264.7 巨噬細胞，使其分泌一氧化氮 (nitric oxide, NO) 及腫瘤壞死因子 TNF-α，
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並提高 RAW 264.7 之 iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18 mRNA 的表現 量 (張，2005)。
PCP 也 可 活 化 小 鼠 腹 腔 巨 噬 細 胞 (peritoneal macrophages) ， 使 其 增 加 MHC-II 及 CD86 的表現，分泌 NO、IL-1β、IL-6、IL-8 及 TNF-α，並提高腹 腔巨噬細胞 NF-κB、TRAF6、TIRAP 及 MyD88 mRNA 的表現量，且 PCP 與腹 腔巨噬細胞培養 8 小時後可使 Toll-like receptor 4 (TLR4) 之 mRNA 表現量上 升，而去除醣蛋白後的 PCP 雖然無法使 TLR4 mRNA 表現增加，但其仍會使腹 腔巨噬細胞分泌 TNF-α，且在 TLR4-/- C57BL/10ScN 小鼠的腹腔巨噬細胞中，
PCP 無法與其腹腔巨噬細胞結合，故 PCP 是經由 TLR4 受器及 MyD88 傳導路 徑以活化腹腔巨噬細胞的免疫刺激物，且 PCP 之醣蛋白單元有助於其與 TLR4 之鍵結 (張，2009; Chang and Sheu, 2009)。此外，在 LAL (Limulus amoebocyte lysate) 凝血試驗中則得知 PCP 對細胞無毒性 (張，2005)。
1.2.2.2 PCP 於 T 細胞之影響
在脾細胞之共培養的研究上，PCP 可活化小鼠脾細胞，促使其中的 CD4+ T 細胞及 B 細胞之增生，誘導 TH1 細胞分化並分泌 γ 干擾素 (interferon gamma, IFN-γ)，並使脾細胞 IL-12 及 IFN-γ 表現量上升，且不使脾細胞分泌 IL-4 (張，
2005；Chang and Sheu, 2009)。
PCP 單獨與 T 細胞共培養時，無法使 T 細胞活化及分泌 IFN-γ，而在有 anti-CD3/CD28 mAbs 存在的情況下，PCP 與小鼠 CD4+ 及 CD8+ T 細胞共培養 後可使細胞活化及增生，並增加 CD4+ 及 CD8+ T 細胞的 CD44 及 CD69 表面 分子表現情形 (張，2009)，此外，去醣後的 PCP 仍可使 CD90.2+ T 細胞分泌 IFN-γ (張，2009)，推測 PCP 具有能促使處女 T 細胞 (TH0) 分化為 TH1 細胞之 能力。
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為了確認 PCP 是否確實誘導 TH1 細胞分化，於免疫沉澱試驗中使用 PCP (100 µg/mL) 與 anti-CD3/CD28 mAbs 及 T 細胞共培養，發現 PCP 可刺激 T 細胞之 TH1 轉錄因子 (transcription factor) 轉錄訊息傳遞及活化子蛋白 4 (signal transducer and activator of transcription 4, STAT4) 表現，且表現量隨時間增加而上 升，並使 T-bet (T-box expressed in T cells) 的 mRNA 表現上升 4.6 倍，且不會 增加 TH2 轉錄因子 STAT6 表現，證明 PCP 的確可刺激 TH1 細胞分化 (張，
2009；Lu et al., 2014)。
於類異位性皮膚炎 (atopic dermatitis) 小鼠模式試驗中，餵食 PCP 可降低淋 巴結細胞之 IL-4 及 IL-5 分泌量、脾細胞之 IL-5 分泌濃度、以及血清中 OVA-specific IgG1、OVA-specific IgE 之 EU 值，並可提升脾細胞 IFN-γ 分泌量 與血清 OVA-specific Ig2a 之含量，故餵食 PCP 可抑制致敏鼠體內之 TH2 免疫 反應 (呂，2011；Lu et al., 2014)。
1.3 樹突細胞 1.3.1 樹突細胞簡介
樹突細胞 (dendritic cell, DC) 以及自然殺手細胞 (nature killer cell, NK cell) 是 先 天 性 免 疫 系 統 (innate immunity system) 及 適 應 性 免 疫 系 統 (adaptive immunity system) 中重要的抗原呈現細胞 (antigen presenting cell, APC)，樹突細胞 因其成熟時會於細胞周圍伸出樹突樣或偽足樣突起而得名，其約佔全部細胞的 1-2%，可參與、調控免疫反應平衡。樹突細胞有許多種類，包括濾泡樹突細胞 (folliculardendritic cell, FDC)、淋巴樹突細胞 (lymphoiddendritic cell, LDC)、並指 狀細胞 (interdigitating cell, IDC) 及郎格罕細胞 (Langerhans cell, LC) (Banchereau and Steinman, 1998; Banchereau et al., 2000)。 未 成 熟 之 樹 突 細 胞 (immature dendritic cell) 則可由淋巴前驅細胞或是骨髓前驅細胞 (bone marrow precursor cell) 受 GM-CSF 刺激分化而來 (Wei et al., 2011)。
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1.3.2 樹突細胞之活化
尚未辨認過病原體蛋白的未成熟樹突細胞多存在於上皮細胞及大部分的器官，
表面具有主要組織相容複合體 (major histocompatibility complex, MHC) I、II 等受 體 (receptor) 可辨識細胞表面的蛋白聚醣 (proteoglycan) 等病原體特徵，也可利 用 DCE205 受體吞噬抗原 (Witmer-Pack et al., 1995)，或是使用 Fc 受體 (FcR) 與免疫球蛋白系之抗體 Fc 結構鍵結，例如 FcγRI (CD64) 及 FcγRIII (CD16) 及 FcγRII (CD32) (Fanger et al., 1996)。未成熟之樹突細胞在淋巴組織中一旦辨認了 病原體、受感染細胞、死細胞或其他可用於抗原傳遞之物質，便會被活化成具有 高效能之抗原呈現細胞，並遊走至血液、鄰近的周圍組織、淋巴系統、培氏斑 (Peyer's patch) 及淋巴結 (lymph node) 呈現病原體的蛋白胜肽，成為可活化淋巴 細胞的專一性細胞，達到辨識抗原、調節胞內運輸與降解作用，以及 MHC 分子 的訊息傳遞 (Guermonprez et al., 2002)。
1.3.3 樹突細胞之表面分子
在 APC 上被描述最為詳細的輔助刺激分子是兩個結構類似的醣蛋白受體 B7.1 (CD80) 及 B7.2 (CD86)，合稱為 B7 分子，可與 T 細胞表面之 CD28 或 CTLA-4 (CD152) 結合，刺激細胞增生或死亡 (Alegre et al., 2001)，而樹突細胞之 CD40 與 CD40 配體 CD154 結合則可傳送活化訊息給 T 細胞 (van Kooten and Banchereau, 2000)，並活化表現 B7 分子的 APC，使 T 細胞更進一步增生 (Bedi and Mead, 2012; Vremec and Shortman, 1997)，CD11c 則是常在樹突細胞上出現的 受體，也有少部分出現在單核球上 (Banchereau and Steinman, 1998)。
1.3.4 樹突細胞活化路徑
樹突細胞活化路徑 TLR 1-10 可傳遞病原體的訊息並活化樹突細胞分泌多種 細胞素 (cytokine)，誘發病原體特異性免疫反應 (Luster , 2006；van Duin et al.,
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2006)，但在 TLR3/4/9 被活化後，樹突細胞上的 CD11c 分子表現則會下降 (Singh-Jasuja et al., 2013)。
最 常 見 的 樹 突 細 胞 活 化 例 子 是 使 用 革 蘭 氏 陰 性 菌 的 脂 多 醣 體 (Lipopolysaccharide, LPS) 之試驗，樹突細胞表面具有辨認 LPS 之受體，此受體 與 TLR4 相關，可活化 NFκB 轉錄因子並表現 B7 分子，使樹突細胞能與處女 T 細胞交互作用 (Lu et al., 2008; Michielsen et al., 2012)。而革蘭氏陽性菌的脂磷壁 酸 (lipoteichoic acid, LTA) 及 肽 聚 醣 (peptidoglycan) Pam3CSK4 (Pam3CysSerLys4) 則可活化 TLR2 並傳遞訊息 (van Duin et al., 2006)。
1.3.5 樹突細胞分泌之細胞素及功能
細胞素是由細胞所釋出的一種蛋白質，會影響其他具有此細胞素受體的免疫 細胞，造成免疫反應或發炎反應 (inflammation) 的發生，例如樹突細胞受活化後，
會分泌 IL-6 以活化淋巴細胞，增加抗體產生；IL-12 則可活化自然殺手細胞 (nature killer cell) 及誘使輔助型 T 細胞 (T helper cell, TH cell) 分化成 TH1 (type 1 T helper cell) 細胞 (Cook et al., 2012)，且輔助型 T 細胞分泌之 IFN-γ 會使樹 突細胞透過過氧化亞硝酸鹽依賴機制 (peroxynitrite-dependent mechanism) 毒殺 癌細胞之能力增加 (LaCasse et al., 2011)；IL-10 則會抑制 TH1 細胞的分化，並 使免疫反應導向 TH2 型 (Liew, 2002; Neurath et al., 2002)。
1.4 輔助型 T 細胞
1.4.1 輔助型 T 細胞之活化
淋巴細胞有兩大類型，第一種是於骨髓中成熟的 B 淋巴細胞 (brusa-derived lymphocytes, B lymphocytes) ， 第 二 種 則 是 於 胸 腺 中 成 熟 的 T 淋 巴 細 胞 (thymus-derived lymphocytes, T lymphocytes)。T 細胞又以不同的表面分子而分為 CD4+ 或 CD8+ 兩種亞群 T 細胞，前者可幫助抗體之生成，故又被稱為輔助型 T
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細胞，後者則可直接將受病原體感染的標靶細胞裂解，因此又被稱為細胞毒殺型 T 細胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) (Liew, 2002)。未接觸過抗原的小型 T 細胞稱 為處女淋巴細胞 (naïve lymphocytes)，可辨識表現抗原胜肽的 MHC-II。樹突細胞 可分泌趨化因子 (chemotactic cytokines, CCK) 使 T 細胞聚集，當 T 細胞認識到 樹突細胞等抗原呈現細胞表面上被表現的特定抗原後，便會開始增殖 (proliferate) 並分化 (differentiate) 成抗原專一性 T 細胞 (antigen-specific T cell)，成熟的淋巴 細 胞 會 持 續 在 血 液 及 淋 巴 組 織 間 循 環 流 動 ， 並 啟 動 細 胞 調 節 免 疫 反 應 (cell-mediated immune response) (Banchereau and Steinman, 1998)。
1.4.2 TH1 型及 TH2 型輔助 T 細胞簡介
輔助型 T 細胞表面會表現 CD4 表面分子，此 TH 細胞分為兩個亞群，分 別為 TH1 及 TH2 輔助型細胞。當 APC 呈現之抗原胜肽數量多，且與 T 細胞受 體結合能力強時，會使免疫反應導向 TH1，反之則為 TH2，因此 APC 之抗原呈 現能力相當重要 (Neurath et al., 2002)。而基因遺傳或環境因素也會透過 T 細胞 受體 (T-cell receptor, TCR) 的配體、共刺激分子的活化、其他 T 細胞分化的細胞 素或是活化後增益的細胞分裂使得 TH1 或 TH2 細胞分化 (Romagnani, 2004)。
TH1 細胞會受到 IFN-γ 及 IL-12 所誘發而分化 (Bedi and Mead, 2012; Cook et al., 2012)，並促使轉錄訊息傳遞及活化子蛋白 STAT4 和 T-bet 表現並增加 IFN-γ 之分泌量 (Romagnani, 2004)，IL-10 則是會抑制其分化，TH1 細胞會釋出 IL-2、IFN-γ 及 TNF-β 等細胞激素及趨化激素 (chemokine) 吸引巨噬細胞至感染 部位，IFN-γ 更可活化巨噬細胞以吞噬細菌及增強 MHC 抗原呈現能力，並誘使 B 細胞分泌調理性免疫球蛋白 G2a (immunoglobulin G2a, IgG2a) 抗體，使外來病 原體更易被細胞吞噬 (Liew, 2002)。
TH2 細胞則會受到細胞素 IL-4、IL-13 誘發分化，其啟動反應可在無 TLR 路徑的情況下被執行 (Romagnani, 2004)，使 STAT6 及 GATA-3 磷酸化，使得
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IFN-γ 的生成受到抑制，並上調 TH2 細胞素 IL-4、IL-5、IL-9 及 IL-13 的分 泌，其中 IL-4 及 IL-13 會活化 B 細胞分泌體液免疫性之免疫球蛋白 E (immunoglobulin E, IgE) 使肥大細胞 (mast cell) 釋放化學物質，造成氣喘等過敏 反應，並破壞細胞外之病原體 (Liew, 2002; Neurath et al., 2002)，IL-5 則可使嗜 酸性球 (eosinophil) 產生，並與 IgE 結合而增強過敏反應 (Romagnani, 2004)。
1.5 過敏性氣喘與 Th 免疫反應之相關性 1.5.1 過敏反應簡介
過敏通常是指第一型過敏反應 (type I allergic reaction) 或是由 IgE 引起的 即時性過敏反應 (immediate-type hypersensitivity reaction)，常見的疾病則包括氣 喘、結膜炎、鼻竇炎、食物過敏、特異性皮膚炎、血管性水腫、蕁麻疹、以及昆 蟲和藥物過敏 (Holgate and Polosa, 2008)。過敏反應的發生與表現則是與基因遺 傳多型性或是與環境的交互作用有關，過去十幾年在美國及歐洲等西方國家，幾 乎有一半以上的人會對環境中常見的抗原產生過敏反應，因此受到環境因子影響 而過敏的患病機率相當高，尤其是在季節變化或環境汙染時更容易使患病率升高 (Romagnani, 2004)。
1.5.2 過敏反應之免疫發生步驟
當人體接觸到過敏原 (allergen) 時，TLR 路徑的受刺激情形會降低，並激活 GATA-3 使細胞進行 TH2 細胞介導的免疫反應，刺激特異性過敏反應發生，TH2 細胞分泌 IL-4、IL-13 促使 B 細胞合成 IgE，IL-4、IL-9 及 IL-13 並使肥大細 胞聚集，IL-3、IL-5 及 GM-CSF 則會使嗜酸性球及嗜鹼性球成熟 (Holgate and Polosa, 2008)，B 細胞分泌之 IgE 可與肥大細胞上的 IgE 高親和力受體 FcεRI 受體結合，嗜酸性球及嗜鹼性球也會表現 FcεRI，並使嗜酸性球釋出促發炎因子，
例如半胱胺酸白三烯 (cysteinyl leukotrienes)、陽離子蛋白、嗜酸性球過氧化酶、
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主要鹼性蛋白及嗜酸性粒細胞原神經毒素 (neurotoxin) 等鹼性蛋白質，誘導 IgE 活化肥大細胞釋放組織胺 (histamine)、白三烯、血小板活化物 (platelet-activating factor, PAF) 細胞素等自體有效媒介物質 (autacoid mediators)，使血管內皮細胞表 現 P-選擇素 (P-selectin) 及 E-選擇素，讓白血球在在血管壁上滾動，造成細胞間 粘附分子 1 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM1) 和血管細胞粘附分子 1 (vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1) 與整合素 (integrin) 受體進行交互作 用，抓住白細胞並協助其通過血管周圍的空間，此為早期過敏反應，通常為 1-30 分鐘，接著隨著細胞素及趨化因子，如 CC-趨化因子配體 2 (CCL2)、CCL3、CCL5 (RANTES)、CCL7、CCL8、CCL13 (單核細胞趨化蛋白 1-4)、CCL24 及 CCL26 (eotaxins1-3) 的釋出，使得巨噬細胞、嗜酸性球及嗜鹼性球聚集，稱為後期過敏 反應，時間會持續達 6-72 小時，這一連串的反應稱為過敏反應 (Holgate and Polosa, 2008；Humbert et al., 1999)。
1.5.3 過敏性氣喘簡介
過敏性氣喘 (asthma) 是常見的過敏反應，氣喘患者的上皮細胞容易受到氧化 壓力而造成傷害，過敏原活化下呼吸道黏膜之肥大細胞後，會造成支氣管收縮、
慢性發炎，而存在於表皮、神經細胞、血管及纖維母細胞生長因子的 IL-13 也會 誘導杯狀細胞 (goblet-cell) 組織特化、黏膜上皮化生 (metaplasia)、分泌黏液、氣 管壁重組，造成肺部氣體進出不易、呼吸困難 (Holgate and Polosa, 2008; Larche et al., 2006)。雖然對於人類在兒童時期時減少接觸到致病性或非致病性的過敏原和 微生物是否會使體內免疫反應變化仍在研究以及議論階段，但在小鼠的試驗中則 發現 6 週大幼年期小鼠的口服耐受性的確比 18 個月大的老年鼠佳，並使抗原特 異性 IgE 及 IgG1 下降 (Birmingham et al., 2013)，且樹突細胞及自然殺手細胞的 TLR 受刺激情形與 IL-12、IFN-γ 及 IFN-α 細胞素分泌量也會隨著年齡增長而
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下降，使得免疫反應無法被導向至 TH1，因此過敏反應的發生也與年齡有相關性 (Romagnani, 2004)。
1.5.4 如何透過調控 TH 免疫反應抑制過敏反應
在減低過敏情形的方法上，除了盡量少接觸過敏原以避免過敏反應發生、吸 入腎上腺皮質類固醇 (corticosteroid)、短效性及長效性 β2 腎上腺素受體激動藥 (short- and long-acting β2 adrenoceptor agonists, SABAs and LABAs) 來降低 TH2 反應及細胞素生成，並使氣管平滑肌放鬆之外，也可藉由誘導體內的 TH1 反應 來減輕過敏反應 (Holgate and Polosa, 2008; Humbert et al., 1999)。由於過敏反應 是受到微量的抗原刺激並產生 IgE 而造成的，且 TH2 細胞會分化並分泌 IL-4、
IL-13 活化 B 細胞及分泌更多 IgE，但在有 IFN-γ 存在的情況下可抑制 IL-4 刺激並產生 IgE 的能力，並聚集更多 T 細胞至過敏部位 (Larche et al., 2006)。
因 此 在 過 敏 反 應 的 研 究 中 ， 過 敏 反 應 發 生 的 原 因 除 了 調 節 性 T 細 胞 (T-regulatory cells, Treg) 活性降低以外，缺乏使 TH2 轉為 TH1 型的過敏原特異 性免疫反應也被認為是其中一個因素，因為 TLR 無法受到刺激並使細胞分泌 IL-12 及 IFN-γ (Romagnani, 2004)。故希望樹突細胞接收到促炎因子訊號後產生 IL-12，使 TH1 細胞分化以降低過敏反應 (Holgate and Polosa, 2008)。
1.6 研究動機與目的
自傳統中醫學至現代生技研究中，金針菇、靈芝等真菌類的萃取物對於調節 並改善免疫能力之研究相當廣泛，由此可知其萃取物作為健康食品有極大潛力，
而在過敏反應的研究中，對於如何透過促進 TH1 細胞分化以抑制 TH2 細胞素產 生及減少過敏反應強度，則是一大重要課題。
在本實驗室之前發表的論文中，已確認茯苓免疫調節蛋白 PCP 可活化小鼠 巨噬細胞，且在 anti-CD3/CD28 mAbs 存在的情況下，PCP 可使 T 細胞活化、
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增生並增加 IFN-γ 分泌濃度，但 PCP 在單獨與 CD90.2+ T 細胞培養的情況下 無法使 T 細胞活化並分泌 IFN-γ，因此假設 PCP 除了可活化巨噬細胞之外，
也會利用其他的抗原呈現細胞，如樹突細胞以間接活化 TH1 細胞增生，且由於 樹突細胞活化後具有調節 T 細胞分化之能力，故希望藉由本試驗可進一步了解 PCP 調節 TH1/ TH2 之機制。
茯苓蛋白 PCP 在萃取後，除了先以 SDS-PAGE 及醣蛋白染色確認萃取出的 茯苓蛋白 PCP 之生化特性外，也藉由 PCP 與骨髓衍生樹突細胞之培養以知曉 PCP 是否能活化樹突細胞。接著利用 DO11.10 小鼠之 OVA 特異性 CD90.2+ T 細胞與受 PCP 刺激後的樹突細胞共培養，觀察 T 細胞免疫反應是否可被導向 TH1 及分泌 IFN-γ，以及其活化樹突細胞之路徑是否與 TLR2 或 TLR4 相關。
最後於動物氣喘模式試驗中探討餵食 PCP 於受 OVA 致敏之氣喘小鼠，是否能 使其體內的免疫反應導向 TH1 以抑制 TH2 免疫反應，減少小鼠的過敏情形。
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第二章 材料與方法
2.1 茯苓蛋白之萃取與分子量檢測 2.1.1 茯苓蛋白粗萃取
[材料]
1. 茯苓樣品來源
購自益壽蔘藥行。中正區寧波西街 49 號。
2. 化學藥品
(1) Tris-base、硫酸銨 (ammonium sulfate, (NH4)2SO4)、冰醋酸 (acetic acid) 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)
(2) 氯 化 鈉 (sodium chloride, NaCl)、 氯 化 氫 Hydrogen chloride (HCl) 、 2-mercaptoethanol 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
3. 試劑
(1) 蛋白萃取液：取 5 mL 之 2-mercaptoethanol、250 mL 之 acetic acid 及 90 克 NaCl ，加入去離子水 (Deionized water, DI) 至 5 L 並混勻。
(2) 1 M Tris buffer：將 157.6 克 Tris-base 加入 850 mL 去離子水，將 pH 調至 8.2 後，再加 DI 至 1 L。稀釋成 0.01 M 使用。
4. 儀器設備及器材 (1) 果汁機 Water blender
(2) 超音波震盪儀 Heatsystem Sonicator XL2020
(3) 低溫離心機 RC5C plus 購自 Sorvall-kendro (Newton, USA) (4) 減壓幫補 DOA-P104-A4 購自 Gast Manutacturiag Inc. (Europe) (5) 110 mm 濾紙購自 Whatman International Ltd. (England)
(6) 透析袋 MW 3000-5000 購自 Spectrum Laboratories Inc. (USA)
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[方法]
將 0.7 公斤之茯苓浸泡於 5 L 蛋白萃取液，放於 4℃ 冰箱 overnight，隔天 將萃取液分批倒入果汁機，並以破碎 90 秒、置冰 90 秒的頻率進行三循環之破碎 步驟，未進行此步驟之萃取液則置於碎冰塊中保持冷藏溫度。其次將破碎後之茯 苓倒入燒杯中並置冰，用超音波震盪儀將強度調到 8，以震 10 秒、停 10 秒，
各十分鐘的頻率再破碎。使用低溫離心機於 4℃ 以 6900 rpm，40 分鐘離心後，
收集上清液並以抽氣過濾機及 110 mm 濾紙過濾，加入 90% 之無水 (NH4)2SO4
於冰箱中攪拌 overnight 使蛋白沉澱，隔天在再以低溫離心機離心 6900 rpm，45 分鐘收集蛋白沉澱。沉澱物加入 0.01 M Tris buffer 回溶後，倒入透析袋 (MW 3000-5000) 浸泡於 0.01 M Tris buffer 中，於冰箱透析四天，期間須換浸泡之 Tris buffer，每日早晚各換一次。透析完後再以低溫離心機離心 9000 rpm，30 分鐘去 除不溶物。
2.1.2 DE-52 陰離子交換管柱層析 [材料]
1. 化學藥品
(1) DE52 (Diethylaminoethyl cellulose) 購自 Whatman (Maidstone, Kent, UK) (2) NaCl、HCl 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(3) Tris-base 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 2. 試劑
1 M Tris buffer：將 157.6 克 Tris base 加入 850 mL DI，並用 1M HCl 將 pH 調 至 8.2 後，再加 DI 至 1 L。稀釋成 0.5 M 及 0.01 M 使用。
3. 儀器設備及器材
(1) NanoDrop ND-1000 微量光譜儀購自 NanoDrop Techonologies (Wilmington, DE, USA)
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(2) 梯度混合器 Gradient mixer
(3) 幫浦管柱收集器 Pump column collector
(4) 15 mL 離心管購自 Corning incorporated (NY, USA)
[方法]
1. 管柱製備：
先以 Nano Drop 測 A280 吸光值之蛋白濃度，算出總蛋白量，並秤取所需之 DE52 重量 (由於 1 g DE52 可容納 0.7 g 蛋白，但會受到其他因素影響而降低收 集蛋白的能力，因此以 1 g DE52 可收集 70 mg 蛋白來計算)。將 DE52 加入 300-360 mL 0.5 M Tris buffer (每 1 g DE52 加入 20 mL Tris buffer) 輕攪混勻後靜 置半小時，溶液分層後將上清液倒掉。加入 300 mL 0.01 M Tris buffer 攪拌混勻，
靜置使溶液分層後倒掉上清液，重複此步驟兩次後加入 50 mL 0.01M Tris buffer，
攪拌後快速倒入層析管柱中，並打開下方閥讓多餘的 Tris buffer 流出，使液面高 於 DE52 約 1.5 cm。將管柱移至冰箱並接上幫浦流通 0.01M Tris buffer (流速=
1.00 mL/min) overnight，隔天測定流下之 buffer pH 值，當 pH 大於 8.2 時即可 放入 2 mm 玻璃珠約一公分高，並使液面維持高於玻璃珠 1-2 mm。
2. 蛋白進樣：
蛋白液通入管柱前須先離心濃縮及過濾。讓蛋白液以 1.00 mL/min 之流速通 入管柱，下方則以血清瓶收 unbind 液，觀察三分鐘確保管柱不會乾掉後，每 5-15 分鐘觀察流動情形，防止管柱流乾。蛋白液全通入管柱後，用另一血清瓶收 unbind 液，之後以 Nano Drop 測流洗液之 A280 吸光值，當濃度約 0.01-0.02 mg/mL 即 可進行下一步驟。
3. 蛋白溶出、收集：
以 0.01 M Tris buffer 配置 0.5 M NaCl 約 150 mL，並準備 150 mL 0.01 M Tris buffer。將 gradient mixer、幫浦及 pump column collector 接好，15 mL 離心
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管放到收集器中，並將 NaCl 及 Tris buffer 同時倒入 gradient mixer，設定收集 器之總收集管數及每管收集體積後，便可將 gradient mixer 兩管之閥、攪拌器、
幫浦及收集器開關打開，並使管柱液面高度維持高於 DE52 小於 1 mm。收集完 成後，以 Nano Drop 測每一管之 A280 吸光值，並收集主要波峰之蛋白液。1 kg 茯 苓約可萃得 120 mg PCP。
2.1.3 蛋白去醣試驗 (Protein deglycosylation test) [材料]
1. 化學藥品
酵素性蛋白去醣套組 (Enzymatic protein deglycosylation kit) 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
2. 儀器設備
細胞培養箱 Hera cell
[方法]
將萃取好之 100 µg 蛋白溶於 35 µL DI 水中，加入 10 µL 5X reaction buffer，
再加入酵素 PNGaseF、O-glycosidase、α-(2→3, 6, 8, 9)-neuraminidase solution、
β-N-acetyl-glucosaminidase、β-(1→4)-galactosidase 各 1 µL，於 37℃ 培養箱中放 3 天後取出，並將 DI 置換成 PBS (phosphate buffered saline) 供後續實驗使用。
2.1.4 SDS 電泳 (SDS-polyacrylamide slab gel electrophoresis) [材料]
1. 化學藥品
(1) APS、N,N,N,N-Tetramethylenthylene-diamine (TEMED)、polyacrylamide 購自 Bio-Rad Laboratories Inc. (USA)
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(2) Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 購自 Mallinckredt Baker (Kentucky, USA)
(3) Sodium dodecyl sulfate (SDS)、glycine 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA) (4) Methonal、Tris-base 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)
2. 試劑
(1) Tank buffer：取 Tris-base 3 g 及 glycine 14.4 g，加入 10% SDS 後再加 DI 至 1L。
(2) 退染劑：500 mL methanol 加 100 mL acetic acid，再加 DI 至 1 L。
(3) APS：取 0.01 g APS 粉末加入 100 mL DI。
(4) 10% SDS：取 10 g SDS 粉末加入 100 mL DI。
3. 儀器設備及器材
(1) 細胞分子照相分析系統 Syngene PXi 購自 J & H Technology Co. Ltd. (Europe) (2) Mini-protein Ⅲ 蛋白質電泳系統 protein electrophoresis system 購自 Bio-Rad
Laboratories Inc. (USA)
[方法]
1. 12.5% polyacrylamide gel 製備 (0.75 mm，兩片膠)：
將 3300 µL DI、 1875 µL Tris-base (pH 8.8)、75 µL 10% SDS、2250 µL 40%
acrylamide、50 µL APS、5.5 µL TEMED 加入錐形瓶搖勻，配製成 running gel (12.5%) 後，將其加入鑄膠片中，並以甲醇加滿鑄膠片以消除氣泡，凝膠 30 分鐘後倒出 甲醇，以 DI 洗三次後擦乾，並加入 stacking gel，配方為 2560 µL DI、1000 µL Tris-base (pH 6.8)、40 µL 10% SDS、400 µL 40% acrylamide、30 µL APS 與 3.4 µL TEMED，均勻混合後加至 running gel 上，並插入尺梳 (comb)，凝膠 30 分鐘後 小心取出尺梳，以 DI 水洗出氣泡後即完成鑄膠。
2. 電泳跑膠及染色：
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架設電泳裝置，並將電泳槽內外都加入 tank buffer。由於一個蛋白槽可加入 20 µL 蛋白液，因此須先加入 4 µL 染劑、50 µg 蛋白，再加 PBS 至 20 µL，並 使用乾式加熱儀加熱 99 ℃，10 分鐘。待蛋白染色完成並冷卻至室溫後，將蛋白 液加入槽中，並加入 4 µL 標準品 (marker) 後，將電泳系統接上電源並設 80 伏 特使蛋白液進入 stacking gel，其後再以 100-120 伏特使蛋白在 running gel 中分 層，染劑跑到底部後停止電泳。取出膠片並切下 stacking gel，留著 running gel 並 放入 CBR 染劑染 20 分鐘，以 DI 水洗一遍後，再以退染劑退染至蛋白條帶清 楚顯現。
2.1.5 PAS (periodic acid-Schiff’s stain) 醣蛋白染色 [材料]
1. 化學藥品
(1) Acetic acid、periodic acid、12.5% TCA (trichloroacetic acid) solution 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(2) Schiff’ reagent 購自 Merck Co. Inc. (Germany) 2. 試劑
過碘酸溶液 Periodic acid solution：含 3% acetic acid 及 1% periodic acid，加水至 100 mL。
[方法]
將跑好之 SDS 膠片放入 TCA solution 中搖晃 1 小時，以 DI 水洗兩次，
一次 5 分鐘，再將膠片放入 periodic acid solution 中搖晃 2 小時使多醣之 CHOH 鍵打開，一樣以 DI 水洗兩次後，於避光條件下加入 Schiff’ reagent 染 20 分鐘，使醣蛋白之醛基還原 Schiff’ reagent 並顯現出紫色條帶，最後再以退染劑 退染至條帶可明顯分辨。
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2.2 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養與免疫活性試驗 [材料]
1. 實驗動物
BALB/c 及 DO11.10 小鼠，購自國家實驗動物中心 2. 化學藥品
(1) RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium 購自 Hyclon, Utah (USA) (2) Fetal bovine serum (FBS) 購自 GIBCO-BRL Life Technologies (Carlsbad, CA,
USA)
(3) KHCO3、H2SO4 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)
(4) Potassium chloride (KCl)、NaCl、di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)、
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 、 NH4Cl 、 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)、Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、trypan blue、
Albumin from bovine serum (BSA)、Concanavalin A (ConA)、MTT (3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl) tetrazolium salt 購 自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(5) IFN-γ ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)
(6) Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween-20)、dimethyl sulfate (DMSO) 購自 JT Baker Inc. (USA)
(7) Gentamycin、Kenamycin 購自 Amresco (Solon, OH, USA)
(8) 95% 酒精 ethanol 購自 友和貿易股份有限公司 (New Taipei City, Taiwan) (9) mouse CD90.2 (Thy1.2) microbeads 磁珠抗體 購自 Miltenyi Biotec (Bergisch
Gladbach, Germany) 3. 試劑
(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2-7.4 後即可使用。
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(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。
(3) MACS (magnetic-activated cell sorting) buffer：稱 0.292 g EDTA 溶於適量 PBS，
EDTA 完全溶解後將 pH 值調至 7.2，並加入 PBS 使體積達到 480 mL，以 0.2 µm 濾膜過濾後高壓滅菌 (A 液)。另取 2.5 g BSA 以 20 mL PBS 溶解，於 無菌操作台 (laminar flow) 內使用 0.22 µm Minisart 針頭濾膜過濾 (B 液)，並 加入 A 液完成配製。
(4) Red blood cell (RBC) lysis buffer : 秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。
(5) 細 胞 培 養 液 ： 將 10% FBS 、 0.1% 10mg/mL Gentamycin 、 0.1% 10mg/mL Kenamycin 加入 RPMI-1640 medium。
(6) MTT solution：MTT 溶於 PBS 中，濃度為 5 mg/mL，並以 0.2 µm 膜過濾。
4. 儀器設備及器材
(1) 細胞培養箱 Hera cell
(2) 離心機 Labofuge 購自 Heraeus group
(3) ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc. (USA) (4) MultiStand 磁板、MidiMACSTM Separator 磁鐵、LS 管柱 購自 Miltenyi Biotec
(Bergisch Gladbach, Germany)
(5) 多孔細胞培養盤 cell culture plate、50 mL 及 15 mL 離心管 centrifuge tube、6 cm dish 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)
(6) 磨砂玻片 76 × 20 mm 購自 KIMBLE ,Gerresheimer group (USA) (7) 0.1 mm deep 細胞計數器 購自 Reichert, Inc. (NY, USA)
(8) 5 mL 針筒 購自 Terumo (Tokyo, Japan)
(9) pH 測量儀 PB-10、0.22 µm Minisart 針頭濾器 購自 Sartorious (Goettingen, Germany)
(10) 三向閥 3 way stopcock 購自 Nipro Medical Industries Ltd. (Tokyo, Japan)
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(11) 半體積 96 孔平底盤 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA) [方法]
2.2.1 脾細胞之取得
將小鼠以二氧化碳犧牲後，用酒精噴滿小鼠全身殺菌並放入無菌操作台之鋁 箔紙上，將腹部左方毛皮以剪刀剪開，並將脾臟取出泡於裝有 PBS 之 6 cm dish 中。使用兩片磨砂玻片夾住脾臟，並將脾臟細胞磨至 PBS 中，磨到只剩下透明 的脾臟外膜後即可將脾細胞吸至 10 mL pipet 中，緩慢小心加入 15 mL 離心管，
防止多餘的脾臟碎塊流入離心管。離心 1500 rpm、4 分鐘，倒掉上清液並刮散細 胞，加入 1 mL RBC lysis buffer 2 分鐘使紅血球破裂後，加入 9mL PBS 停止反 應，離心 1500 rpm、4 分鐘後倒掉上清液，可見到細胞團已變成白色，刮散細胞 並加入 5 mL RPMI medium 計數。
2.2.2 從脾細胞中分離 CD90.2+ T 細胞
將 5 mL MACS buffer 加入脾細胞並計數，離心 1500rpm、4 分鐘後依每 107 顆細胞的 1/3 加入 10 µL CD90.2 磁株抗體，並加入 MACS buffer 將體積補至 1 mL，置於 4℃ 冰箱 20-25 分鐘。等待時間可將磁板、磁鐵、5 mL 針筒、廢 液桶、LS 管柱、置冰之兩管 50 mL MACS buffer 及 200 mL 燒杯照射紫外光殺 菌，10 分鐘後可架設管柱並平衡。將磁鐵放上磁板，順過三向閥及針筒後，將針 筒、三向閥及管柱組合至磁鐵上，以針筒吸滿 MACS buffer 並將液體推入管柱 中 (針筒內之 buffer 不少於 2 mL)，再調整三向閥至左方使 buffer 流至廢液桶，
快流完時由上方加入 3 mL buffer，快流完即平衡完成，注意管柱不可乾掉。
與磁珠抗體反應完之脾細胞先離心 1500 rpm、4 分鐘，倒吊上清、再加入 5 mL MACS buffer 洗兩次，洗完後將 0.5 mL MACS buffer 加入細胞，混勻後再加 進管柱中，下方放置裝有冰的 200 mL 燒杯，內放 50 mL 離心管，並以 2 mL MACS buffer 沖洗剛剛裝有細胞的離心管，並加入管柱中。下方 50 mL 離心管
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收 2.5 mL unbinding 細胞後，再重新將 unbinding 細胞加入管柱，重複兩次後開 始進行流洗步驟，由上方加入 MACS buffer，並收 unbinding 細胞液約 30 mL 後，
將內含 3-4 mL buffer 之管柱從磁鐵上拆下，並大力將管柱內含 T 細胞之 MACS buffer 推入 15 mL 離心管，離心 1500 rpm、4 分鐘後計數 T 細胞及 unbinding (none T) 細胞。
2.2.3 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養
將欲培養之脾細胞、CD90.2+ T 細胞及 PCP 濃度調至欲培養濃度的兩倍 (細 胞：2×107 cells/mL)，各取細胞與蛋白液 50 µL 加入 96-well plate，於 37℃ 細 胞培養箱中培養 3 天後，方可取得細胞上清液及進行下一步實驗。若要養於 48-well plate 中，則各取 100 µL 細胞與蛋白液加入 well 中，以此類推。正控制 組則以 ConA (5 µg/mL) 培養細胞。
2.2.4 MTT 細胞活性試驗
細胞與蛋白培養 72 小時後，於 96-well plate 中加入 20 µL MTT solution，
並於 37℃ 培養箱中培養 5 小時，plate 離心 1500 rpm、4 分鐘後，將培養液吸 出，再加入等量的 DMSO 替代，置於培養箱 5 分鐘後以 ELISA reader 測 540 nm 吸光值。
2.2.5 IFN-γ 細胞素之 ELISA 酵素免疫分析法測定
所有抗體皆於 IFN-γ ELISA kit 中。Capture antibody 以 PBS 稀釋 180 倍後，
於半體積 96-well plate 加入 50 µL/well，在室溫下放置 overnight，隔天倒掉上清，
先以 ELISA washing buffer 150 µL/well 清洗 well 5 次，再加入 blocking buffer 100 µL/well，於室溫下放 1 小時後，一樣以 ELISA washing buffer 洗 5 次，倒 乾並加入 sample 與已稀釋成 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 及 15.625
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pg/mL 之標準品 50 µL/well，於室溫放 2 小時後清洗 5 次並加入稀釋 180 倍 之 detection antibody，50 µL/well 放 2 小時，清洗 5 次再加入稀釋 200 倍之 HRP 50 µL/well，放 20 分鐘後清洗 8 次、倒乾液體並加入 TMB solution 50 µL/well，等 2000 pg/mL 標準品呈明顯天藍色後以 20 µL/well 1 M H2SO4 停止反 應。
2.3 茯苓蛋白與樹突細胞之培養與樹突細胞活化 T 細胞能力試驗 [材料]
1. 實驗動物
(1) 4 週大之 BALB/c 及 8-12 週大之 DO11.10 小鼠 購自國家實驗動物中心 (Taiwan)
(2) TLR2-/- 及 TLR4-/- 受 器 缺 陷 小 鼠 購 自 The Jackson Laboratory (Maine, U.S.A)
2. 化學藥品
(1) KCl、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4Cl、Dipotassium phosphate (K2HPO4)、
trypan blue、BSA、Concanavalin A (ConA) 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(2) KHCO3、H2SO4、Tween-20購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) (3) IFN-γ 及 IL-4 ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)
(4) IL-6 ELISA kit 購自 eBioscience Inc. (CA, USA) (5) RPMI medium 購自 Hyclon (Utah, USA)
(6) Gentamycin、Kenamycin 購自 Amresco (Solon, OH, USA) (7) FBS 購自 GIBCO-BRL Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)
(8) 95% 酒精 ethanol 購自友和貿易股份有限公司 (New Taipei City, Taiwan) (9) PE/Cy5-conjugated CD11c、CD4；FITC-conjugated CD40、CD80、CD86；
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PerCP/Cy5.5-conjugated CD11c 之 小 鼠 表 面 分 子 特 異 性 抗 體 購 自 eBioscience (San Diego, CA, USA)
(10) FITC-conjugated CD80 小鼠表面分子特異性抗體 購自 Biolegned Inc. (CA, USA)
(11) LPS-EK Ultrapure、Pam3CSK4 購自 InvivoGen (San Diego, CA, USA)
(12) CellTraceTM CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) kit 購自 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)
(13) NaN3 購自 Riedel-deHaën® (Seelze, Germany) (14) OVA323-339 peptide 購自 Anaspec Inc. (CA, USA)
(15) Recombinant murine GM-CSF 購自 PeproTech Inc. (NJ, USA) 3. 試劑
(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2 - 7.4 後即可使用。
(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。
(3) FACS 鞘液：取 75.2 g K2HPO4、13.2 g NaH2PO4、72 g NaCl，以 DI 溶解並 加至 1 L，配製 10 倍濃的鞘液。使用前以 DI 稀釋至 1 倍，並以 0.2 µm 濾 膜過濾。
(4) FACS buffer：於 1 倍之 FACS 鞘液中加入 2 % FBS、0.1 % (w/w) NaN3 溶 解混勻後，以鞘液加至 500 mL，並以 0.22 µm 濾膜過濾，保存於 4 °C 冰 箱中。
(5) RBC lysis buffer : 秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。
(6) 細胞培養液：將 10% FBS、0.1% 10mg/mL Gentamycin、0.1% 10mg/mL Kenamycin 加入 RPMI-1640 medium。
4. 儀器設備及器材
