腎保護作用

茯苓菌核水萃物 WPC 與小鼠腎集合管上皮細胞 IMCD-3 培養之體外試驗 中，可減少細胞的高滲透壓力及水通道蛋白 Aquaporin-2 (AQP2) 之 mRNA 表現 量，提升張力應答增強結合蛋白 (Tonicity-responsive enhancer binding protein, TonEBP) mRNA 的表現，以減緩腎細胞受高滲透壓影響而死亡的情形 (Lee et al., 2012)。餵食茯苓多醣給腎發炎之大鼠 10 天後，發現其可降低尿蛋白排泄量以及 血清膽固醇之上升情形，並使血清補體 (serum complement) CH50 下降，於腎小 球 (glomeruli) 之病理組織切片中也可觀察到餵食茯苓多醣能減少腎小囊中的細 胞黏附情形，故茯苓多醣具有抗原始型腎發炎之活性 (Hattori et al., 1992)。餵食 200 mg/kg 茯苓菌核皮層之乙醇萃取物 FLP (Fu-Ling-Pi) 則可透過降低體內排尿 量及腎重指標、提升血細胞比容 (hematocrit) 來抑制腺嘌呤誘導的慢性腎臟病 (Zhao et al., 2013b) 。 以 UPLC Q-TOF/HSMS (quadrupole time-of-flight high-sensitivity mass spectrometry) 及 MS^E (mass spectrometryElevated Energy

) 則可知 乙醇萃取物 FLP 透過參與脂肪酸代謝、磷脂代謝、嘌呤代謝及色胺酸代謝等主 要代謝途徑，來增強腎保護作用，預防早期腎損傷 (Zhao et al., 2013a)。

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1.2 茯苓蛋白之前人研究 1.2.1 茯苓蛋白 PCP 之生化特性

本實驗室之張慧欣學姊經由硫酸銨蛋白沉澱、透析、DEAE-52 陰離子交換管 柱及 FPLC (fast protein liquid chromatography) 層析，由茯苓菌核中萃取出茯苓免 疫調節蛋白蛋白 PCP (Poria cocos protein)，跑 native-PAGE 電泳及 FPLC 後觀 察到一波峰，由蛋白通過 FPLC 管柱的時間推測 PCP 分子量約 35.6 kDa，而以 SDS-PAGE 電泳分析及醣蛋白染色則可知 PCP 包含分子量為 21.3 kDa 之醣蛋 白單元及 14.3 kDa 之蛋白單元。由 21.3 kDa 及 14.3 kDa 蛋白片段之胺基酸組 成比例結果則可得知兩蛋白單元之胺基酸組成相似 (張，2009；Chang and Sheu, 2009)，推測其蛋白組成應為同一蛋白，而由螢光染色法可得知茯苓蛋白 PCP 存 在於茯苓菌絲的細胞壁、細胞膜及細胞核部位中 (張，2005)。

在 PCP 的基因選殖上，呂雅婷學姊利用 PCP 的 N 端胺基酸序列合成 PCP 之引子，並利用 rapid amplification cDNA end (RACE) 方法選殖出長約 807 bp、

open read frame (ORF) 為 579 bp 之 cDNA，選殖的基因序列轉譯出的胺基酸片 段約為 194 個，分子量為 12.765 kDa，且以軟體推測醣化形式與位置預測後，

得知其胺基酸序列於第 142 個位置可能具有 N-glycosylation 之修飾作用。將序 列 轉 至 大 腸 桿 菌 株 製 成 (His)6-PCP 重 組 蛋 白 ， 並 以 張 慧 欣 學 姊 所 做 出 的 anti-PCP 單株抗體進行西方轉漬法分析，預估此重組蛋白大小約 17-26 kDa (呂，

2011；Lu et al., 2014)。

1.2.2 茯苓蛋白 PCP 之生物活性 1.2.2.1 PCP 於 APCs 之影響

在張慧欣學姊過去的研究中，發現茯苓免疫調節蛋白 PCP 可活化 RAW 264.7 巨噬細胞，使其分泌一氧化氮 (nitric oxide, NO) 及腫瘤壞死因子 TNF-α，

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並提高 RAW 264.7 之 iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18 mRNA 的表現 量 (張，2005)。

PCP 也 可 活 化 小 鼠 腹 腔 巨 噬 細 胞 (peritoneal macrophages) ， 使 其 增 加 MHC-II 及 CD86 的表現，分泌 NO、IL-1β、IL-6、IL-8 及 TNF-α，並提高腹 腔巨噬細胞 NF-κB、TRAF6、TIRAP 及 MyD88 mRNA 的表現量，且 PCP 與腹 腔巨噬細胞培養 8 小時後可使 Toll-like receptor 4 (TLR4) 之 mRNA 表現量上 升，而去除醣蛋白後的 PCP 雖然無法使 TLR4 mRNA 表現增加，但其仍會使腹 腔巨噬細胞分泌 TNF-α，且在 TLR4^-/- C57BL/10ScN 小鼠的腹腔巨噬細胞中，

PCP 無法與其腹腔巨噬細胞結合，故 PCP 是經由 TLR4 受器及 MyD88 傳導路 徑以活化腹腔巨噬細胞的免疫刺激物，且 PCP 之醣蛋白單元有助於其與 TLR4 之鍵結 (張，2009; Chang and Sheu, 2009)。此外，在 LAL (Limulus amoebocyte lysate) 凝血試驗中則得知 PCP 對細胞無毒性 (張，2005)。

1.2.2.2 PCP 於 T 細胞之影響

在脾細胞之共培養的研究上，PCP 可活化小鼠脾細胞，促使其中的 CD4⁺ T 細胞及 B 細胞之增生，誘導 TH1 細胞分化並分泌 γ 干擾素 (interferon gamma, IFN-γ)，並使脾細胞 IL-12 及 IFN-γ 表現量上升，且不使脾細胞分泌 IL-4 (張，

2005；Chang and Sheu, 2009)。

PCP 單獨與 T 細胞共培養時，無法使 T 細胞活化及分泌 IFN-γ，而在有 anti-CD3/CD28 mAbs 存在的情況下，PCP 與小鼠 CD4⁺ 及 CD8⁺ T 細胞共培養 後可使細胞活化及增生，並增加 CD4⁺ 及 CD8⁺ T 細胞的 CD44 及 CD69 表面 分子表現情形 (張，2009)，此外，去醣後的 PCP 仍可使 CD90.2⁺ T 細胞分泌 IFN-γ (張，2009)，推測 PCP 具有能促使處女 T 細胞 (TH0) 分化為 TH1 細胞之 能力。

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為了確認 PCP 是否確實誘導 TH1 細胞分化，於免疫沉澱試驗中使用 PCP (100 µg/mL) 與 anti-CD3/CD28 mAbs 及 T 細胞共培養，發現 PCP 可刺激 T 細胞之 TH1 轉錄因子 (transcription factor) 轉錄訊息傳遞及活化子蛋白 4 (signal transducer and activator of transcription 4, STAT4) 表現，且表現量隨時間增加而上 升，並使 T-bet (T-box expressed in T cells) 的 mRNA 表現上升 4.6 倍，且不會 增加 TH2 轉錄因子 STAT6 表現，證明 PCP 的確可刺激 TH1 細胞分化 (張，

2009；Lu et al., 2014)。

於類異位性皮膚炎 (atopic dermatitis) 小鼠模式試驗中，餵食 PCP 可降低淋 巴結細胞之 IL-4 及 IL-5 分泌量、脾細胞之 IL-5 分泌濃度、以及血清中 OVA-specific IgG1、OVA-specific IgE 之 EU 值，並可提升脾細胞 IFN-γ 分泌量 與血清 OVA-specific Ig2a 之含量，故餵食 PCP 可抑制致敏鼠體內之 TH2 免疫 反應 (呂，2011；Lu et al., 2014)。

1.3 樹突細胞 1.3.1 樹突細胞簡介

樹突細胞 (dendritic cell, DC) 以及自然殺手細胞 (nature killer cell, NK cell) 是 先 天 性 免 疫 系 統 (innate immunity system) 及 適 應 性 免 疫 系 統 (adaptive immunity system) 中重要的抗原呈現細胞 (antigen presenting cell, APC)，樹突細胞 因其成熟時會於細胞周圍伸出樹突樣或偽足樣突起而得名，其約佔全部細胞的 1-2%，可參與、調控免疫反應平衡。樹突細胞有許多種類，包括濾泡樹突細胞 (folliculardendritic cell, FDC)、淋巴樹突細胞 (lymphoiddendritic cell, LDC)、並指 狀細胞 (interdigitating cell, IDC) 及郎格罕細胞 (Langerhans cell, LC) (Banchereau and Steinman, 1998; Banchereau et al., 2000)。 未 成 熟 之 樹 突 細 胞 (immature dendritic cell) 則可由淋巴前驅細胞或是骨髓前驅細胞 (bone marrow precursor cell) 受 GM-CSF 刺激分化而來 (Wei et al., 2011)。

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1.3.2 樹突細胞之活化

尚未辨認過病原體蛋白的未成熟樹突細胞多存在於上皮細胞及大部分的器官，

表面具有主要組織相容複合體 (major histocompatibility complex, MHC) I、II 等受 體 (receptor) 可辨識細胞表面的蛋白聚醣 (proteoglycan) 等病原體特徵，也可利 用 DCE205 受體吞噬抗原 (Witmer-Pack et al., 1995)，或是使用 Fc 受體 (FcR) 與免疫球蛋白系之抗體 Fc 結構鍵結，例如 FcγRI (CD64) 及 FcγRIII (CD16) 及 FcγRII (CD32) (Fanger et al., 1996)。未成熟之樹突細胞在淋巴組織中一旦辨認了 病原體、受感染細胞、死細胞或其他可用於抗原傳遞之物質，便會被活化成具有 高效能之抗原呈現細胞，並遊走至血液、鄰近的周圍組織、淋巴系統、培氏斑 (Peyer's patch) 及淋巴結 (lymph node) 呈現病原體的蛋白胜肽，成為可活化淋巴 細胞的專一性細胞，達到辨識抗原、調節胞內運輸與降解作用，以及 MHC 分子 的訊息傳遞 (Guermonprez et al., 2002)。

1.3.3 樹突細胞之表面分子

在 APC 上被描述最為詳細的輔助刺激分子是兩個結構類似的醣蛋白受體 B7.1 (CD80) 及 B7.2 (CD86)，合稱為 B7 分子，可與 T 細胞表面之 CD28 或 CTLA-4 (CD152) 結合，刺激細胞增生或死亡 (Alegre et al., 2001)，而樹突細胞之 CD40 與 CD40 配體 CD154 結合則可傳送活化訊息給 T 細胞 (van Kooten and Banchereau, 2000)，並活化表現 B7 分子的 APC，使 T 細胞更進一步增生 (Bedi and Mead, 2012; Vremec and Shortman, 1997)，CD11c 則是常在樹突細胞上出現的 受體，也有少部分出現在單核球上 (Banchereau and Steinman, 1998)。

1.3.4 樹突細胞活化路徑

樹突細胞活化路徑 TLR 1-10 可傳遞病原體的訊息並活化樹突細胞分泌多種 細胞素 (cytokine)，誘發病原體特異性免疫反應 (Luster , 2006；van Duin et al.,

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2006)，但在 TLR3/4/9 被活化後，樹突細胞上的 CD11c 分子表現則會下降 (Singh-Jasuja et al., 2013)。

最 常 見 的 樹 突 細 胞 活 化 例 子 是 使 用 革 蘭 氏 陰 性 菌 的 脂 多 醣 體 (Lipopolysaccharide, LPS) 之試驗，樹突細胞表面具有辨認 LPS 之受體，此受體 與 TLR4 相關，可活化 NFκB 轉錄因子並表現 B7 分子，使樹突細胞能與處女 T 細胞交互作用 (Lu et al., 2008; Michielsen et al., 2012)。而革蘭氏陽性菌的脂磷壁 酸 (lipoteichoic acid, LTA) 及 肽 聚 醣 (peptidoglycan) Pam3CSK4 (Pam3CysSerLys4) 則可活化 TLR2 並傳遞訊息 (van Duin et al., 2006)。

1.3.5 樹突細胞分泌之細胞素及功能

細胞素是由細胞所釋出的一種蛋白質，會影響其他具有此細胞素受體的免疫 細胞，造成免疫反應或發炎反應 (inflammation) 的發生，例如樹突細胞受活化後，

會分泌 IL-6 以活化淋巴細胞，增加抗體產生；IL-12 則可活化自然殺手細胞 (nature killer cell) 及誘使輔助型 T 細胞 (T helper cell, TH cell) 分化成 TH1 (type 1 T helper cell) 細胞 (Cook et al., 2012)，且輔助型 T 細胞分泌之 IFN-γ 會使樹 突細胞透過過氧化亞硝酸鹽依賴機制 (peroxynitrite-dependent mechanism) 毒殺 癌細胞之能力增加 (LaCasse et al., 2011)；IL-10 則會抑制 TH1 細胞的分化，並 使免疫反應導向 TH2 型 (Liew, 2002; Neurath et al., 2002)。

1.4 輔助型 T 細胞

1.4.1 輔助型 T 細胞之活化

淋巴細胞有兩大類型，第一種是於骨髓中成熟的 B 淋巴細胞 (brusa-derived lymphocytes, B lymphocytes) ， 第 二 種 則 是 於 胸 腺 中 成 熟 的 T 淋 巴 細 胞 (thymus-derived lymphocytes, T lymphocytes)。T 細胞又以不同的表面分子而分為 CD4⁺ 或 CD8⁺ 兩種亞群 T 細胞，前者可幫助抗體之生成，故又被稱為輔助型 T

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細胞，後者則可直接將受病原體感染的標靶細胞裂解，因此又被稱為細胞毒殺型 T 細胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) (Liew, 2002)。未接觸過抗原的小型 T 細胞稱 為處女淋巴細胞 (naïve lymphocytes)，可辨識表現抗原胜肽的 MHC-II。樹突細胞 可分泌趨化因子 (chemotactic cytokines, CCK) 使 T 細胞聚集，當 T 細胞認識到 樹突細胞等抗原呈現細胞表面上被表現的特定抗原後，便會開始增殖 (proliferate) 並分化 (differentiate) 成抗原專一性 T 細胞 (antigen-specific T cell)，成熟的淋巴 細 胞 會 持 續 在 血 液 及 淋 巴 組 織 間 循 環 流 動 ， 並 啟 動 細 胞 調 節 免 疫 反 應 (cell-mediated immune response) (Banchereau and Steinman, 1998)。

1.4.2 TH1 型及 TH2 型輔助 T 細胞簡介

輔助型 T 細胞表面會表現 CD4 表面分子，此 TH 細胞分為兩個亞群，分 別為 TH1 及 TH2 輔助型細胞。當 APC 呈現之抗原胜肽數量多，且與 T 細胞受 體結合能力強時，會使免疫反應導向 TH1，反之則為 TH2，因此 APC 之抗原呈 現能力相當重要 (Neurath et al., 2002)。而基因遺傳或環境因素也會透過 T 細胞 受體 (T-cell receptor, TCR) 的配體、共刺激分子的活化、其他 T 細胞分化的細胞 素或是活化後增益的細胞分裂使得 TH1 或 TH2 細胞分化 (Romagnani, 2004)。

TH1 細胞會受到 IFN-γ 及 IL-12 所誘發而分化 (Bedi and Mead, 2012; Cook et al., 2012)，並促使轉錄訊息傳遞及活化子蛋白 STAT4 和 T-bet 表現並增加 IFN-γ 之分泌量 (Romagnani, 2004)，IL-10 則是會抑制其分化，TH1 細胞會釋出 IL-2、IFN-γ 及 TNF-β 等細胞激素及趨化激素 (chemokine) 吸引巨噬細胞至感染 部位，IFN-γ 更可活化巨噬細胞以吞噬細菌及增強 MHC 抗原呈現能力，並誘使 B 細胞分泌調理性免疫球蛋白 G2a (immunoglobulin G2a, IgG2a) 抗體，使外來病 原體更易被細胞吞噬 (Liew, 2002)。

TH2 細胞則會受到細胞素 IL-4、IL-13 誘發分化，其啟動反應可在無 TLR 路徑的情況下被執行 (Romagnani, 2004)，使 STAT6 及 GATA-3 磷酸化，使得

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IFN-γ 的生成受到抑制，並上調 TH2 細胞素 IL-4、IL-5、IL-9 及 IL-13 的分 泌，其中 IL-4 及 IL-13 會活化 B 細胞分泌體液免疫性之免疫球蛋白 E (immunoglobulin E, IgE) 使肥大細胞 (mast cell) 釋放化學物質，造成氣喘等過敏 反應，並破壞細胞外之病原體 (Liew, 2002; Neurath et al., 2002)，IL-5 則可使嗜 酸性球 (eosinophil) 產生，並與 IgE 結合而增強過敏反應 (Romagnani, 2004)。

1.5 過敏性氣喘與 Th 免疫反應之相關性 1.5.1 過敏反應簡介

過敏通常是指第一型過敏反應 (type I allergic reaction) 或是由 IgE 引起的 即時性過敏反應 (immediate-type hypersensitivity reaction)，常見的疾病則包括氣 喘、結膜炎、鼻竇炎、食物過敏、特異性皮膚炎、血管性水腫、蕁麻疹、以及昆

過敏通常是指第一型過敏反應 (type I allergic reaction) 或是由 IgE 引起的 即時性過敏反應 (immediate-type hypersensitivity reaction)，常見的疾病則包括氣 喘、結膜炎、鼻竇炎、食物過敏、特異性皮膚炎、血管性水腫、蕁麻疹、以及昆