4.1 PCP 活化樹突細胞之討論及其與 TLR 路徑之相關性
樹突細胞上的表面分子具有輔助刺激免疫反應並傳達抗原給 T 細胞之功能，
樹突細胞分泌之細胞素則可誘導處女淋巴細胞分化成 TH1、TH2 或 TH17 等不同 種類的細胞，造成不同類型免疫反應發生。本次利用 FACScan 所觀察的樹突細 胞表面分子包含 CD40、CD80 及 CD86，CD40 在活化後除了可進一步活化 CD80 及 CD86 這兩個 B7 分子之外，也會分泌 IL-12 使免疫反應導向 TH1 (van Kooten and Banchereau, 2000)，CD80 和 CD86 表達情形增加之後則會與 T 細胞之 CD28 結合，使 T 細胞增生並分泌 IL-2 等細胞素 (Alegre et al., 2001)，
而 PCP (100 µg/mL) 與 BALB/c 小鼠之樹突細胞共同培養 24 小時後，與對照組 相比之下可使 CD40、CD80 及 CD86 螢光表現情形皆明顯增加，因此 PCP 可 使樹突細胞對 T 細胞之呈現能力上升，並推測受 PCP 活化的樹突細胞具有分泌 IL-12 使 T 細胞增生、導向 TH1 免疫反應的能力，而在樹突細胞分泌的細胞素 濃度測定上，也驗證了 PCP 刺激活化樹突細胞確實具有使 IL-12 分泌濃度增加 的能力，與前面 CD40 表面分子表現增加的結果相符。此外，樹突細胞受 PCP 刺 激後也會分泌大量 IL-6，推測樹突細胞可能也會影響 TH17 細胞之分化，未來若 要往 TH17 免疫反應之方向研究，除了 IL-6 以外也可測樹突細胞分泌 TGF-β 及 IL-23 之濃度。
TLR 之激活機制對於疾病進入體內的檢測、活化樹突細胞並引發一連串免疫 反應佔有重要地位，與 TLR6 為異源二聚體的 TLR2 可受到肽聚醣 Pam3CSK4 等細菌成分刺激而活化，使 IL-8 和 IL-23 被表達，而 TLR4 則可偵測革蘭氏陰 性菌釋出的 LPS、呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus, RSV) 的融合蛋白 或小鼠乳腺腫瘤病毒 (mouse mammary tumor virus, MMTV) 的膜蛋白及其他內 源性分子 (例如熱休克蛋白、透明質酸和 β-防禦素 2) 等，辨識感染性病原體上
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的相關分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)、介導細胞素的生 成並活化免疫系統，活化後的 TLR4 可透過非 MyD88 的 TRIF 路徑活化 I 型 干擾素 (IFN-α、IFN-β) 基因，使巨噬細胞分泌 I 型干擾素，達到抗病毒之作用，
也可透過 MyD88 路徑活化促發炎細胞素之生成，使血清中的 IL-6、TNF-α 及 IL-12p70 濃度上升，進而調節 TH 免疫反應的平衡 (Lu et al., 2008)。前人將 PCP 與腹腔巨噬細胞共同培養，發現 PCP 可上調與 TLR2 及 TLR4 相關性及高的 NF-κB、MyD88、TIRAP 及 TRAF6 之基因表現情形，以及 TNA-α、iNOS、IL-1β、
IL-6、IL-12 及 IL-18 的 mRNA 表現 (張，2005；Chang and Sheu, 2009)，由 TLR4 之 mRNA 表現量及 TLR4-/- 小鼠分泌 NO 和 TNF-α 之分析結果則指出 PCP 具有透過 TLR4 來活化巨噬細胞的能力 (Chang and Sheu, 2009)，本實驗則欲從 TLR2-/- 及 TLR4-/- 鼠的樹突細胞與 PCP 培養後的表面分子表現及 IL-6 細胞 素分泌狀況來初步瞭解 PCP 透過何種路徑去活化樹突細胞，發現 TLR4-/- 小鼠 的樹突細胞受到 PCP 刺激活化後的 CD40、CD80、CD86 表面分子表現量及 IL-6 分泌濃度與對照組相比之下皆有下降情形，但由於 PCP 對於 TLR4-/- 小鼠 樹突細胞的活化抑制情形並非完全抑制，因此仍須透過使用 anti-TLR2 及 anti-TLR4 抗 體 分 析 PCP 活 化 樹 突 細 胞 之 路 徑 是 否 同 時 受 到 或 完 全 不 受 到 TLR2 及 TLR4 之影響。
4.2 PCP 透過活化樹突細胞誘導 TH1 反應
PCP 不能直接刺激 CD90.2+ T 細胞活化並分泌 IFN-γ (圖二、圖三)，只能在 有 anti-CD3/CD28 抗體的情況下才可刺激 CD90.2+ T 細胞增生，且增生結果與 PCP 及脾細胞共培養時相似，並使 T 細胞 CD44、CD69 表現量、 IFN-γ 及 TNF-α 分泌濃度上升 (Lu et al., 2008)。而本實驗則是先證明 PCP 可活化樹突細 胞後，再使用預先與 PCP 培養 24 小時並辨認 OVA 抗原的樹突細胞與對 OVA 具有特異性的 DO11.10 小鼠 之 CD90.2+ T 細胞培養，發現 PCP 能增加樹突細
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胞將抗原呈現給 CD90.2+ T 細胞，使 T 細胞增生並分泌 IFN-γ、減少 TH2 細胞 之 IL-4 分泌量，讓免疫反應導向 TH1 型細胞的能力，因此 PCP 確實可藉由活 化樹突細胞，使樹突細胞之 CD40 及 B7 表面分子表現量與介導 TH1 細胞增生 的 IL-12p70 細胞素分泌量增加，並間接使 T 細胞增生以及使免疫反應導向 TH1 方向，因而抑制了 TH2 免疫反應的發生。
4.3 餵食 PCP 於小鼠氣喘動物模式之討論
為了確認 PCP 是否能藉由調節 TH 免疫反應使 TH1 細胞增生、TH2 細胞 分化受到抑制，因此使用了 TH2 相關的呼吸道過敏動物模式，並以餵食的方式 在小鼠開始對 OVA 過敏後每日服用不同濃度的 PCP 茯苓蛋白萃取物，最後再 由 BALF 中的 TH1、TH2 相關細胞素、血清免疫球蛋白及肺部切片探討 PCP 藉 由誘導 TH1 細胞分化而抑制 TH2 過敏反應的能力。
當巨噬細胞或樹突細胞等抗原呈現細胞接收到抗原後，便會將抗原呈現給 T 細胞而引發 TH2 反應，其中 TH2 細胞分泌的 IL-4 及 IL-13 會使 B 細胞分泌 IgE 並活化肥大細胞，IL-5 則會使嗜酸性球分化並造成細胞浸潤情形 (Holgate and Polosa, 2008; Humbert et al., 1999)。比較 IL-4、IL-13 及 OVA 特異性 IgE 的 結果後，可明顯看出 PCP (100 µg/d) 組的細胞素及免疫球蛋白分泌量皆有被抑制，
而每日餵食 50 µg/d PCP 組之 IL-4 及 IL-13 抑制成果則略比餵食 200 µg/d PCP 組佳，在 OVA 特異性 IgE 的分泌抑制上也可明顯看出每日餵食 50 µg PCP 的效果較每日餵食 200 µg PCP 之組別佳。
而在會促使嗜酸性球分化的 IL-5 分泌結果中，雖然餵食 PCP 50 µg/d 及 200 µg/d 的 IL-5 分泌濃度與 positive control 的 OVA 組相比之下無顯著差異，
但在 BALF 中的嗜酸性球數目上，只要是有服用 PCP 的組別，與對照組相比之 下嗜酸性球數目皆有被抑制下來，餵食 200 µg/d PCP 之嗜酸性球分化抑制效果 也與餵食 100 µg/d PCP 組無差異。IL-5 在小鼠及人類中被認為是使嗜酸性球分
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化及成熟最重要的因子，當 IL-5 過度表達 (over-expression) 時會增加體內嗜酸 性球及抗體含量 (Kouro and Takatsu. 2009)，此外，肺上皮細胞的嗜酸性球趨化激 素受體 CCR3 (Eotaxin receptor) 則可與其餘趨化激素結合，誘導嗜酸性球之趨化 作用並上調 TH2 免疫反應 (Lamkhioued et al., 2003)，但是當 IL-12 (1-20 ng/mL) 及 IFN-γ 的濃度增加時，CCR3 的表達能力則會明顯減少，因而抑制了骨髓始祖 細胞 (myeloid progenitor) 的嗜酸性球分化情形 (Lamkhioued et al., 2003；Rais et al., 2002)。由於本次未有足夠之 BALF 測 IL-12 濃度，故無法確認 IL-12 是否 影響到嗜酸性球的分化，而在 50 µg/d 及 200 µg/d PCP 組 BALF 中之 IL-5 及 IFN-γ 也與 OVA 組無顯著差異，其他可能則為支氣管細胞受到 IL-12、IFN-γ 及 CCR 受體表達影響，使得嗜酸性球分化、聚集情形減少。此外，嗜酸性球也會造 成過敏反應發生處的細胞浸潤及增厚，在肺部組織切片的 H & E 染色結果中即 可明顯觀察到 OVA 致敏對照組的肺部組織切片有較多的細胞增厚情形，而在餵 食 100 µg/d PCP 的組別中，由於其 BALF 中的 TH2 細胞素 IL-5 分泌濃度減少，
加上有 TH1 細胞分泌 IFN-γ，使得嗜酸性球分化情形受到抑制，故細胞浸潤情形 不會像沒有餵食 PCP 的 OVA 組一樣嚴重。
而在誘導 TH1 免疫反應的能力上，IL-12 會誘發 TH1 細胞分化，並活化 STAT4 及 T-bet 之表達，使 IFN-γ 分泌並影響 B 細胞分泌抗原特異性之 IgG2a (Liew, 2002；Romagnani, 2004)，前人研究中也指出 PCP 可使 STAT4 磷酸化、
增加 T-bet 之 mRNA 表現量，且於口服 PCP 的異位性皮膚炎動物試驗中也發 現口服 PCP 可增加 TH1 相關之細胞素 IFN-γ 及免疫球蛋白 IgG2a 濃度，並抑 制 TH2 細胞素的生成 (Lu et al., 2014)，而在本次餵食 PCP 的氣喘動物模式試驗 中，以腹腔注射 OVA 之方式使小鼠致敏而對 OVA 產生特異性過敏反應後，餵 食 100 µg/d PCP 可明顯增加 BALF 內的 TH1 細胞素 IFN-γ 濃度，且會使 B 細胞受刺激並分泌 IgG2a，因此可在血清中觀察到 OVA 特異性 IgG2a 含量增加 的情形，代表小鼠致敏後餵食 100 µg/d PCP 確實可誘導呼吸道之 TH1 細胞分化，
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使得免疫反應導向 TH1，並抑制 TH2 誘導的過敏反應。而餵食 PCP 50 µg/d 或 200 µg/d 之小鼠 BALF 中 TH1 細胞素 IFN-γ 分泌量與 OVA 組相似，因此在 這兩組小鼠血清中，B 細胞分泌的 OVA 特異性 IgG2a 含量與 OVA 組沒有顯 著差異，推測每日餵食 50 µg 或 200 µg PCP 無法顯著抑制 TH2 過敏，若要再 更進一步確認最佳的 PCP 餵食濃度，則可選擇介於 50 µg/d 及 200 µg/d 之間的 PCP 餵食濃度進行試驗。
4.4 結論
由 以 上 實 驗 結 果 可 知 PCP 可 透 過 包 含 TLR4 之 路 徑 活 化 樹 突 細 胞 的 CD40、CD80 及 CD86 表面分子，並讓樹突細胞分泌 IL-12p70、刺激處女 T 細 胞分化成 TH1，使免疫反應導向 TH1 及分泌 IFN-γ。而在小鼠氣喘動物模式試 驗中，每日餵食 100 µg PCP 可增加 BALF 中的 TH1 細胞素 IFN-γ 及血清中的 OVA 特異性 IgG2a 含量，使 TH1 免疫反應上升，並抑制 BALF 中的嗜酸性球 數、TH2 細胞素 IL-4、IL-5 及 IL-13 濃度，以及血清之 OVA 特異性 IgE 含量，
且可減少肺部組織的細胞增厚、浸潤情形。根據以上實驗結果茯苓免疫調節蛋白
PCP 可透過具有抗原呈現效果之樹突細胞調節淋巴細胞的 TH1 免疫反應，並抑
制 TH2 氣喘反應造成的細胞素及免疫球蛋白增加。
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