第二章 材料與方法
2.1 茯苓蛋白之萃取與分子量檢測
2.1.4 SDS 電泳
1. 化學藥品
酵素性蛋白去醣套組 (Enzymatic protein deglycosylation kit) 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
2. 儀器設備
細胞培養箱 Hera cell
[方法]
將萃取好之 100 µg 蛋白溶於 35 µL DI 水中，加入 10 µL 5X reaction buffer，
再加入酵素 PNGaseF、O-glycosidase、α-(2→3, 6, 8, 9)-neuraminidase solution、
β-N-acetyl-glucosaminidase、β-(1→4)-galactosidase 各 1 µL，於 37℃ 培養箱中放 3 天後取出，並將 DI 置換成 PBS (phosphate buffered saline) 供後續實驗使用。
2.1.4 SDS 電泳 (SDS-polyacrylamide slab gel electrophoresis) [材料]
1. 化學藥品
(1) APS、N,N,N,N-Tetramethylenthylene-diamine (TEMED)、polyacrylamide 購自 Bio-Rad Laboratories Inc. (USA)
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(2) Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 購自 Mallinckredt Baker (Kentucky, USA)
(3) Sodium dodecyl sulfate (SDS)、glycine 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA) (4) Methonal、Tris-base 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)
2. 試劑
(1) Tank buffer：取 Tris-base 3 g 及 glycine 14.4 g，加入 10% SDS 後再加 DI 至 1L。
(2) 退染劑：500 mL methanol 加 100 mL acetic acid，再加 DI 至 1 L。
(3) APS：取 0.01 g APS 粉末加入 100 mL DI。
(4) 10% SDS：取 10 g SDS 粉末加入 100 mL DI。
3. 儀器設備及器材
(1) 細胞分子照相分析系統 Syngene PXi 購自 J & H Technology Co. Ltd. (Europe) (2) Mini-protein Ⅲ 蛋白質電泳系統 protein electrophoresis system 購自 Bio-Rad
Laboratories Inc. (USA)
[方法]
1. 12.5% polyacrylamide gel 製備 (0.75 mm，兩片膠)：
將 3300 µL DI、 1875 µL Tris-base (pH 8.8)、75 µL 10% SDS、2250 µL 40%
acrylamide、50 µL APS、5.5 µL TEMED 加入錐形瓶搖勻，配製成 running gel (12.5%) 後，將其加入鑄膠片中，並以甲醇加滿鑄膠片以消除氣泡，凝膠 30 分鐘後倒出 甲醇，以 DI 洗三次後擦乾，並加入 stacking gel，配方為 2560 µL DI、1000 µL Tris-base (pH 6.8)、40 µL 10% SDS、400 µL 40% acrylamide、30 µL APS 與 3.4 µL TEMED，均勻混合後加至 running gel 上，並插入尺梳 (comb)，凝膠 30 分鐘後 小心取出尺梳，以 DI 水洗出氣泡後即完成鑄膠。
2. 電泳跑膠及染色：
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架設電泳裝置，並將電泳槽內外都加入 tank buffer。由於一個蛋白槽可加入 20 µL 蛋白液，因此須先加入 4 µL 染劑、50 µg 蛋白，再加 PBS 至 20 µL，並 使用乾式加熱儀加熱 99 ℃，10 分鐘。待蛋白染色完成並冷卻至室溫後，將蛋白 液加入槽中，並加入 4 µL 標準品 (marker) 後，將電泳系統接上電源並設 80 伏 特使蛋白液進入 stacking gel，其後再以 100-120 伏特使蛋白在 running gel 中分 層，染劑跑到底部後停止電泳。取出膠片並切下 stacking gel，留著 running gel 並 放入 CBR 染劑染 20 分鐘，以 DI 水洗一遍後，再以退染劑退染至蛋白條帶清 楚顯現。
2.1.5 PAS (periodic acid-Schiff’s stain) 醣蛋白染色 [材料]
1. 化學藥品
(1) Acetic acid、periodic acid、12.5% TCA (trichloroacetic acid) solution 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(2) Schiff’ reagent 購自 Merck Co. Inc. (Germany) 2. 試劑
過碘酸溶液 Periodic acid solution：含 3% acetic acid 及 1% periodic acid，加水至 100 mL。
[方法]
將跑好之 SDS 膠片放入 TCA solution 中搖晃 1 小時，以 DI 水洗兩次，
一次 5 分鐘，再將膠片放入 periodic acid solution 中搖晃 2 小時使多醣之 CHOH 鍵打開，一樣以 DI 水洗兩次後，於避光條件下加入 Schiff’ reagent 染 20 分鐘，使醣蛋白之醛基還原 Schiff’ reagent 並顯現出紫色條帶，最後再以退染劑 退染至條帶可明顯分辨。
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2.2 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養與免疫活性試驗 [材料]
1. 實驗動物
BALB/c 及 DO11.10 小鼠，購自國家實驗動物中心 2. 化學藥品
(1) RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium 購自 Hyclon, Utah (USA) (2) Fetal bovine serum (FBS) 購自 GIBCO-BRL Life Technologies (Carlsbad, CA,
USA)
(3) KHCO3、H2SO4 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)
(4) Potassium chloride (KCl)、NaCl、di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)、
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 、 NH4Cl 、 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)、Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、trypan blue、
Albumin from bovine serum (BSA)、Concanavalin A (ConA)、MTT (3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl) tetrazolium salt 購 自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(5) IFN-γ ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)
(6) Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween-20)、dimethyl sulfate (DMSO) 購自 JT Baker Inc. (USA)
(7) Gentamycin、Kenamycin 購自 Amresco (Solon, OH, USA)
(8) 95% 酒精 ethanol 購自 友和貿易股份有限公司 (New Taipei City, Taiwan) (9) mouse CD90.2 (Thy1.2) microbeads 磁珠抗體 購自 Miltenyi Biotec (Bergisch
Gladbach, Germany) 3. 試劑
(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2-7.4 後即可使用。
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(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。
(3) MACS (magnetic-activated cell sorting) buffer：稱 0.292 g EDTA 溶於適量 PBS，
EDTA 完全溶解後將 pH 值調至 7.2，並加入 PBS 使體積達到 480 mL，以 0.2 µm 濾膜過濾後高壓滅菌 (A 液)。另取 2.5 g BSA 以 20 mL PBS 溶解，於 無菌操作台 (laminar flow) 內使用 0.22 µm Minisart 針頭濾膜過濾 (B 液)，並 加入 A 液完成配製。
(4) Red blood cell (RBC) lysis buffer : 秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。
(5) 細 胞 培 養 液 ： 將 10% FBS 、 0.1% 10mg/mL Gentamycin 、 0.1% 10mg/mL Kenamycin 加入 RPMI-1640 medium。
(6) MTT solution：MTT 溶於 PBS 中，濃度為 5 mg/mL，並以 0.2 µm 膜過濾。
4. 儀器設備及器材
(1) 細胞培養箱 Hera cell
(2) 離心機 Labofuge 購自 Heraeus group
(3) ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc. (USA) (4) MultiStand 磁板、MidiMACSTM Separator 磁鐵、LS 管柱 購自 Miltenyi Biotec
(Bergisch Gladbach, Germany)
(5) 多孔細胞培養盤 cell culture plate、50 mL 及 15 mL 離心管 centrifuge tube、6 cm dish 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)
(6) 磨砂玻片 76 × 20 mm 購自 KIMBLE ,Gerresheimer group (USA) (7) 0.1 mm deep 細胞計數器 購自 Reichert, Inc. (NY, USA)
(8) 5 mL 針筒 購自 Terumo (Tokyo, Japan)
(9) pH 測量儀 PB-10、0.22 µm Minisart 針頭濾器 購自 Sartorious (Goettingen, Germany)
(10) 三向閥 3 way stopcock 購自 Nipro Medical Industries Ltd. (Tokyo, Japan)
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(11) 半體積 96 孔平底盤 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA) [方法]
2.2.1 脾細胞之取得
將小鼠以二氧化碳犧牲後，用酒精噴滿小鼠全身殺菌並放入無菌操作台之鋁 箔紙上，將腹部左方毛皮以剪刀剪開，並將脾臟取出泡於裝有 PBS 之 6 cm dish 中。使用兩片磨砂玻片夾住脾臟，並將脾臟細胞磨至 PBS 中，磨到只剩下透明 的脾臟外膜後即可將脾細胞吸至 10 mL pipet 中，緩慢小心加入 15 mL 離心管，
防止多餘的脾臟碎塊流入離心管。離心 1500 rpm、4 分鐘，倒掉上清液並刮散細 胞，加入 1 mL RBC lysis buffer 2 分鐘使紅血球破裂後，加入 9mL PBS 停止反 應，離心 1500 rpm、4 分鐘後倒掉上清液，可見到細胞團已變成白色，刮散細胞 並加入 5 mL RPMI medium 計數。
2.2.2 從脾細胞中分離 CD90.2+ T 細胞
將 5 mL MACS buffer 加入脾細胞並計數，離心 1500rpm、4 分鐘後依每 107 顆細胞的 1/3 加入 10 µL CD90.2 磁株抗體，並加入 MACS buffer 將體積補至 1 mL，置於 4℃ 冰箱 20-25 分鐘。等待時間可將磁板、磁鐵、5 mL 針筒、廢 液桶、LS 管柱、置冰之兩管 50 mL MACS buffer 及 200 mL 燒杯照射紫外光殺 菌，10 分鐘後可架設管柱並平衡。將磁鐵放上磁板，順過三向閥及針筒後，將針 筒、三向閥及管柱組合至磁鐵上，以針筒吸滿 MACS buffer 並將液體推入管柱 中 (針筒內之 buffer 不少於 2 mL)，再調整三向閥至左方使 buffer 流至廢液桶，
快流完時由上方加入 3 mL buffer，快流完即平衡完成，注意管柱不可乾掉。
與磁珠抗體反應完之脾細胞先離心 1500 rpm、4 分鐘，倒吊上清、再加入 5 mL MACS buffer 洗兩次，洗完後將 0.5 mL MACS buffer 加入細胞，混勻後再加 進管柱中，下方放置裝有冰的 200 mL 燒杯，內放 50 mL 離心管，並以 2 mL MACS buffer 沖洗剛剛裝有細胞的離心管，並加入管柱中。下方 50 mL 離心管
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收 2.5 mL unbinding 細胞後，再重新將 unbinding 細胞加入管柱，重複兩次後開 始進行流洗步驟，由上方加入 MACS buffer，並收 unbinding 細胞液約 30 mL 後，
將內含 3-4 mL buffer 之管柱從磁鐵上拆下，並大力將管柱內含 T 細胞之 MACS buffer 推入 15 mL 離心管，離心 1500 rpm、4 分鐘後計數 T 細胞及 unbinding (none T) 細胞。
2.2.3 茯苓蛋白與脾細胞、CD90.2+ T 細胞之培養
將欲培養之脾細胞、CD90.2+ T 細胞及 PCP 濃度調至欲培養濃度的兩倍 (細 胞：2×107 cells/mL)，各取細胞與蛋白液 50 µL 加入 96-well plate，於 37℃ 細 胞培養箱中培養 3 天後，方可取得細胞上清液及進行下一步實驗。若要養於 48-well plate 中，則各取 100 µL 細胞與蛋白液加入 well 中，以此類推。正控制 組則以 ConA (5 µg/mL) 培養細胞。
2.2.4 MTT 細胞活性試驗
細胞與蛋白培養 72 小時後，於 96-well plate 中加入 20 µL MTT solution，
並於 37℃ 培養箱中培養 5 小時，plate 離心 1500 rpm、4 分鐘後，將培養液吸 出，再加入等量的 DMSO 替代，置於培養箱 5 分鐘後以 ELISA reader 測 540 nm 吸光值。
2.2.5 IFN-γ 細胞素之 ELISA 酵素免疫分析法測定
所有抗體皆於 IFN-γ ELISA kit 中。Capture antibody 以 PBS 稀釋 180 倍後，
於半體積 96-well plate 加入 50 µL/well，在室溫下放置 overnight，隔天倒掉上清，
先以 ELISA washing buffer 150 µL/well 清洗 well 5 次，再加入 blocking buffer 100 µL/well，於室溫下放 1 小時後，一樣以 ELISA washing buffer 洗 5 次，倒 乾並加入 sample 與已稀釋成 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 及 15.625
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pg/mL 之標準品 50 µL/well，於室溫放 2 小時後清洗 5 次並加入稀釋 180 倍 之 detection antibody，50 µL/well 放 2 小時，清洗 5 次再加入稀釋 200 倍之 HRP 50 µL/well，放 20 分鐘後清洗 8 次、倒乾液體並加入 TMB solution 50 µL/well，等 2000 pg/mL 標準品呈明顯天藍色後以 20 µL/well 1 M H2SO4 停止反 應。
2.3 茯苓蛋白與樹突細胞之培養與樹突細胞活化 T 細胞能力試驗 [材料]
1. 實驗動物
(1) 4 週大之 BALB/c 及 8-12 週大之 DO11.10 小鼠 購自國家實驗動物中心 (Taiwan)
(2) TLR2-/- 及 TLR4-/- 受 器 缺 陷 小 鼠 購 自 The Jackson Laboratory (Maine, U.S.A)
2. 化學藥品
(1) KCl、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4Cl、Dipotassium phosphate (K2HPO4)、
trypan blue、BSA、Concanavalin A (ConA) 購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
(2) KHCO3、H2SO4、Tween-20購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) (3) IFN-γ 及 IL-4 ELISA kit 購自 R&D system Inc. (MN, USA)
(4) IL-6 ELISA kit 購自 eBioscience Inc. (CA, USA) (5) RPMI medium 購自 Hyclon (Utah, USA)
(6) Gentamycin、Kenamycin 購自 Amresco (Solon, OH, USA) (7) FBS 購自 GIBCO-BRL Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)
(8) 95% 酒精 ethanol 購自友和貿易股份有限公司 (New Taipei City, Taiwan) (9) PE/Cy5-conjugated CD11c、CD4；FITC-conjugated CD40、CD80、CD86；
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PerCP/Cy5.5-conjugated CD11c 之 小 鼠 表 面 分 子 特 異 性 抗 體 購 自 eBioscience (San Diego, CA, USA)
(10) FITC-conjugated CD80 小鼠表面分子特異性抗體 購自 Biolegned Inc. (CA, USA)
(11) LPS-EK Ultrapure、Pam3CSK4 購自 InvivoGen (San Diego, CA, USA)
(12) CellTraceTM CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) kit 購自 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)
(13) NaN3 購自 Riedel-deHaën® (Seelze, Germany) (14) OVA323-339 peptide 購自 Anaspec Inc. (CA, USA)
(15) Recombinant murine GM-CSF 購自 PeproTech Inc. (NJ, USA) 3. 試劑
(1) PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4 以 DI 溶解後，將 pH 質調整至 7.2 - 7.4 後即可使用。
(2) ELISA washing buffer：於 PBS 中加入 0.05% (v/v) 之 tween 20。
(3) FACS 鞘液：取 75.2 g K2HPO4、13.2 g NaH2PO4、72 g NaCl，以 DI 溶解並 加至 1 L，配製 10 倍濃的鞘液。使用前以 DI 稀釋至 1 倍，並以 0.2 µm 濾 膜過濾。
(4) FACS buffer：於 1 倍之 FACS 鞘液中加入 2 % FBS、0.1 % (w/w) NaN3 溶 解混勻後，以鞘液加至 500 mL，並以 0.22 µm 濾膜過濾，保存於 4 °C 冰 箱中。
(5) RBC lysis buffer : 秤取 155 mM NH4Cl、100 mM EDTA、10 mM KHCO3 於 PBS 中。
(6) 細胞培養液：將 10% FBS、0.1% 10mg/mL Gentamycin、0.1% 10mg/mL Kenamycin 加入 RPMI-1640 medium。
4. 儀器設備及器材
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(1) 細胞培養箱 Hera cell
(2) 離心機 Labofuge 購自 Heraeus group
(3) ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc. (USA) (4) 流式細胞儀 FACScan、流式細胞儀上樣管 Falcon tube 購自 BD Biosciences
(San Jose, CA, USA)
(5) 多孔細胞培養盤 cell culture plate、50 mL 及 15 mL 離心管 centrifuge tube、6 cm dish、20 µm 無菌濾網 cell strainer 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)
(6) 0.1 mm deep 細胞計數器 購自 Reichert Inc. (NY, USA)
(7) 旋渦式震盪器 Vortex-Genie2 購自 Sientific Industries (Bohemia, NY, USA) (8) 1 mL 針購自 Terumo (Tokyo, Japan)
(9) 0.22 µm Minisart 濾膜 購自 Sartorious (Goettingen, Germany) (10) 96 孔 V 底盤 96-well V plate 購自 Nunc (Rochester, NY, USA)
(11) 半體積 96 孔平底盤 購自 Corning Life Science (Tewksbury, MA, USA)
[方法]
2.3.1 骨髓衍生樹突細胞之取得方式
將四週大之小鼠以二氧化碳犧牲後，全身噴酒精殺菌消毒並放入無菌操作台 之鋁箔紙上，以剪刀及鑷子剪開小鼠腹部中央之毛皮，沿著小鼠腰部撕開外皮後，
先將一隻腳的外皮以剪刀及鑷子輔助脫除並連同鼠掌一同剪下，再以另一組乾淨 剪刀及鑷子剪下連同髖部下方關節之鼠腿，以確保其骨髓細胞未流失，將鼠腿以 棉花清除上面的皮毛後泡於 PBS 中清洗血水。以第三組剪刀及鑷子將腿部之肉 剪除，剩下的碎肉則可用紗布磨下，磨乾淨之腿骨浸泡於酒精中 5 分鐘，再以乾 淨的 PBS 洗淨腿骨。
將腿骨由關節處扭斷使骨髓露出，把用來去除細胞雜塊的濾膜放到 50 mL
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離心管上，並使用 1 mL 針吸滿 medium，插入骨髓洞口，將骨髓細胞沖入離心 管中離心 1500 rpm、8 分鐘，去除上清液並刮散細胞後，加入 500 µL RBC lysis buffer 反應 30 秒，再加入 4.5 mL PBS 停止反應，離心 1500 rpm、4 分鐘後去 除上清液並刮散細胞，加入 3 mL medium 即可計數細胞。
2.3.2 茯苓蛋白與樹突細胞之培養
取得樹突細胞後，將其濃度調成 2×106 cells/mL，並加 1 mL 於 6-well plate 中，再加入以 medium 稀釋之 GM-CSF (500 unit/mL)，1 mL/well，於 37℃ 之 培養箱中培養 7-14 天，每隔 3 天換一次含 GM-CSF 的 medium，使骨髓細胞 能衍生成未成熟之樹突細胞。樹突細胞衍生完成後，將細胞濃度調成 2×106 cells/mL、LPS 及 PCP 濃度調成兩倍後，加入細胞培養盤中培養 24 小時，隔天 即可收集上清液並進行下一步實驗。
2.3.3 樹突細胞與 DO11.10 CD90.2+ T 細胞之培養
將已培養 7-14 天之樹突細胞或預先以 OVA 及 LPS、PCP 培養好之樹突細 胞與分選好之 DO11.10 CD90.2+ T 細胞分別配成 1.8×106 cells/mL 及 1.8×107 cells/mL (DC:T=1:10) 以利 T 細胞增生 (Höpken et al., 2005)，分別取 50 µL/well 加入 48-well plate，再將 OVA (10 µg/mL) 加入，100 µL/well，使最終 OVA 濃度 為 5 µg/mL。另以 ConA (5 µg/mL) 做為活化 T 細胞之正控制組測試。
2.3.4 樹突細胞之表面分子檢測
將培養好之細胞收至 eppendorf，離心 2000 rpm、3 分鐘後收取細胞上清液，
加入所需體積之 FACS buffer 並混勻細胞後，下細胞至 96-well V 盤 (1×105 in 100 µL FACS buffer/well)。離心 2000 rpm、3 分鐘後倒乾上清並以 vortex 震散細 胞，重複此清洗步驟 2 次。於避光條件下加入 1 µL/well PE-conjugated CD11c 抗
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體染樹突細胞及 FITC-conjugated C40/CD80/CD86 抗體染欲觀察之表面分子，並 加入 100 µL/well FACS buffer，包鋁箔紙避光並放入 4℃ 冰箱，40 分鐘後依照 上面之清洗步驟於避光條件下洗 3 次，用 pipetman 混勻 100 µL 細胞後過篩加 入 falcon tube，再加入 500 µL FACS buffer，置冰並使用流式細胞儀 FACScan 測 平均螢光強度 (mean fluorescent intensity, MFI) 及與對照組之差異百分比。
體染樹突細胞及 FITC-conjugated C40/CD80/CD86 抗體染欲觀察之表面分子，並 加入 100 µL/well FACS buffer，包鋁箔紙避光並放入 4℃ 冰箱，40 分鐘後依照 上面之清洗步驟於避光條件下洗 3 次，用 pipetman 混勻 100 µL 細胞後過篩加 入 falcon tube，再加入 500 µL FACS buffer，置冰並使用流式細胞儀 FACScan 測 平均螢光強度 (mean fluorescent intensity, MFI) 及與對照組之差異百分比。