有絲分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinases；MAPKs) 會回應細胞外來的刺激，進而調控細胞之活性，例如：基因表現、有絲 分裂、細胞分化、和細胞之存活或凋亡等[53-55]。為釐清 CHM-1 所誘發的 SKOV3 細胞凋亡是否包含 MAPKs 訊息傳遞途徑，因此利用西方墨點分 析法檢測 ERKs, p38 及 JNK 之表現。以 0.125 µM 之 CHM-1 處理 PC-3 細胞，當 ERK1/2 磷酸化產物 phospho-ERK1/2 表現被抑制時，phospho-JNK 表現量不受影響。相對的，在投藥處理 6, 12,和 24 小時後，很明顯可觀 察到 CHM-1 (0.125 µM) 誘發 p38 的磷酸化 (見圖 18A)，由此推測 p38 的活化是 CHM-1 誘發細胞凋亡的重要機制之一。
為了求證此一推論，我們使用 SB203580 做進一步確認。SB203580 是 p38 活化之專一抑制劑，結構屬於 pyridinyl imidazole 衍生物[49]。如圖 18B 所示，SB203580 會減弱 CHM-1 在 SKOV3 細胞所誘發的 DR5 表現 和 caspase-3 的活化。同時，以 0.125 µM 之 CHM-1 處理 24 小時後，收 集之 lysate 經流式細胞計數分析，結果顯示有 24.59 % 之 SKOV3 細胞會 停留在 sub-G1 phase (apoptotic cells)；然而，先以 10 µM SB203580 前處 理 (pre-incubated) SKOV3 細胞 1 小時，再以 0.125 µM 之 CHM-1 處理 24 小時，則停留在 sub-G1 phase 之 SKOV3 細胞只剩約 5.27 % (見圖 19)。
Figure 18 Expressions of MAPKs in the CHM-1-treated SKOV3 cells. (A) SKOV3 cells were treated with 0.125 µM CHM-1 for indicated durations.
Cells were then harvested and lysed for detection of ERK1/2, p-ERK1/2, p38, p-p38, JNK, p-JNK, and β-actin. (B) SKOV3 cells were treated with 0.125 µM CHM-1 in the presence or absence of SB203580 (10 µM), and the expressions
of p-p38, DR5, cleaved caspase-3, and β-actin were detected. Western blot data presented are representative of those obtained in at least 3 separate
experiments. The values below the figures represent the changes in the protein expression normalized to β-actin.
既有文獻已證實 p38 能調控 DR5 的表現[33]，同時相關研究指出，p38 可作用在 caspases 誘導細胞凋亡之上游或下游，且 p38 在細胞凋亡過程 中所扮演的角色端視細胞和刺激之類型而定[56, 57]。在本研究中發現，
SKOV3 細胞經 CHM-1 處理 6 小時後，p38 的磷酸化程度會增加。p38 磷 酸化後會緊接著觸發 caspase cascade，進而誘發人類卵巢癌 SKOV3 細胞
凋亡，由此推測 p38 誘發卵巢癌 SKOV3 細胞凋亡是作用在 caspases cascade 之上游。
Figure 19 Flow cytometry analysis of the sub-G1 population of CHM-1-treated SKOV3 cells. Flow cytometry revealed that pre-treatment
with 10µM SB203580 markedly reduced apoptosis among CHM-1-treated SKOV3 cells. The sub-G1 phase was identified by flow cytometric analysis in
triplicate from 3 independent experiments. Data are presented as means ± S.D. ∗∗, P < 0.01 versus CHM-1-treated cells not treated with SB203580.
綜合以上之實驗結果明確顯示，CHM-1 向上調節死亡接受器 5，並增 強 TRAIL 蛋白質的表現，且 CHM-1 誘發細胞凋亡之分子機制，與 p38 介導上調死亡接受器 5 之表現有密切關聯。本研究首次報導 CHM-1 能藉 由 DR5 轉導的調控機制誘發人類卵巢癌 SKOV3 細胞之凋亡。由 PARP (a caspase-3 substrate) 之 蛋 白 質 代 謝 退 化 (proteolytic degradation) 指 出 ， CHM-1 誘發人類卵巢癌 SKOV3 細胞凋亡之機制包括 caspase 的活化：
CHM-1 能誘發 caspase-3 和 caspase-8 之活化，被活化的 caspase-8 會分裂 並活化 caspases 之效應物，如 caspase-3 和 caspase-7，而導致細胞凋亡。
TRAIL是DR 4及DR 5相對應之配體，既有文獻報導，TRAIL能有選擇 性的觸發變形癌細胞之凋亡[29, 30]。增強TRAIL的表現，並刺激 DR 4亦或 DR 5會誘發某些特定細胞株之凋亡，包括大腸癌、前列腺癌、膀胱癌和 慢性淋巴球白血病[31, 32]。近年來，許多研究亦已證實TRAIL能差異的對 變形細胞和異種移植的腫瘤具有毒性，但對正常細胞幾乎沒有毒性，使 得TRAIL受到許多臨床學家極大的關注，成為癌症治療的理想標的[33-36]。
CHM-1能增強TRAIL之表現，並藉由p38介導上調DR 5，進而誘發人 類卵巢癌SKOV3細胞凋亡，意謂CHM-1是一安全、有效之抗腫瘤製劑，
有潛力發展成為臨床抗卵巢癌之藥物。
第二節、CHM-1 於活體內之抗腫瘤活性評估
由於卵巢癌主要局部發生於女性腹腔，以集中部位做為治療策略之化 學療法，將有助於提昇其治療效果，目前許多臨床詴驗已證實局部腹腔 注射化療藥物能增加卵巢癌病患之存活率[10]，NCI 亦建議手術切除腫瘤 後，宜再併用 i.v 或 i.p 之化學療法[85-88]。因此，建立一個可靠的，確 實的動物異種移植模式 (xenograft model)，是藥物進入臨床詴驗前，評估 其治療效果的重要步驟。然而，監控腹腔疾病的發展和演變相對困難許 多，傳統的抗腫瘤活性評估主要是測量腫瘤之體積和總質量，但此一方 式多在達到實驗終點前即已犧牲實驗動物，如此一來將會增加實驗動物
的耗損量，也無法長期持續觀察同一動物之腫瘤發展情形。除此之外，
許多腫瘤細胞會造成部分組織的細胞壞死 (necrosis)或產生水腫現象 (oedema)，傳統的評估方式勢必將無法做正確的評估，所以，必頇應用其 他不同的步驟和評估方式。
有鑑於此，為正確、有效評估 CHM-1在活體內的抗腫瘤活性，首先，
我們利用傳統的評估方式，以皮下異種移植模式(subcutaneous xenograft model)，將卵巢腺癌細胞注射至female BALB/c nude mice之右腰脥，以腹 腔注射(i.p)之投藥方式，分別給予不同劑量的CHM-1或CHM-1-P加以治 療，藉以評估相同基本結構，不同溶解度之不同藥物是否會有相同的腫 瘤抑制效果。同時，利用原位移植腫瘤模式，將卵巢癌SKOV-3 ip1/luc 細 胞 (i.p) 移植至female BALB/c nude mice 腹腔，再應用生物發光影像 (bioluminescent imaging) 原理，以 in vivo imaging system (IVIS) 監控經 腹腔注射CHM-1治療的卵巢腺癌裸鼠，觀察並統計其腫瘤生長及殘存情 形。另一個實驗亦應用相同之原位移植腫瘤模式，改以靜脈血管注射水 溶性之CHM-1-P治療卵巢腺癌小鼠，觀察並統計卵巢腺癌小鼠之存活情 形。
茲將CHM-1及CHM-1-P於活體內之抗腫瘤活性評估結果分述如下：