第四章 材料與方法
4.4 環境驗證與暴露初探
4.4.1 土壤
為定量土壤中棘阿米巴原蟲，於2012 年 3、4 月選擇位於屏東縣車城鄉及恆 春鎮的9 塊洋蔥田(表五) (N=12)、2012 年 7 月於台灣大學園藝農場之 30 塊蔬果/
香草植物田(表六) (N=36)以及農藝農場之 5 塊水稻田(表七) (N=5) 進行土壤採 樣。
表五：屏東縣車城鄉與恆春鎮洋蔥田之採樣點經緯度座標 Farm Latitude and Longitude
HC1 22.041651,120.727041 HC3 22.042149,120.721806 HC4 22.041413,120.720454 HC5 22.041194,120.723029 HC6 22.042358,120.723351 CC1 22.075449,120.716613 CC2 22.062106,120.726999 CC3 22.060973,120.729155 CC4 22.076573,120.714875
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表六：台灣大學園藝農場蔬果/香草植物田之採樣點經緯度座標 Farm Latitude and Longitude Farm Latitude and Longitude A1 25.013335,121.546726 B1 25.013245,121.546797 A2 25.013332,121.546706 B2 25.01324,121.546776 A3 25.013318,121.546686 B3 25.013228,121.54676 A4 25.013309,121.546666 B4 25.013215,121.546741 A5 25.013298,121.546652 B5 25.013203,121.546721 A6 25.013283,121.546636 B6 25.013192,121.546705 A7 25.013271,121.546619 B7 25.013185,121.546691 A8 25.01326,121.546599 B8 25.013176,121.546671 A9 25.013247,121.546581 B9 25.013162,121.546652 A10 25.013237,121.546565 B10 25.013144,121.546637 A11 25.013226,121.546549 B11 25.013135,121.546616 A12 25.013214,121.546532 B12 25.013127,121.546599 A13 25.013202,121.546513 B13 25.013118,121.546581 A14 25.013192,121.546491 B14 25.013098,121.546565 A15 25.013182,121.546474 B15 25.013086,121.546545
表七：台灣大學農藝農場水稻田之採樣點經緯度座標 Farm Latitude and Longitude
C1 25.015861,121.54061
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蔬果/香草植物田之採樣方法係將田平均切成四等分，使用鏟子在每等分的中 心點進行採樣(圖五 B)，採樣面積為 100 cm2，深度為1 cm，此四等分的樣本會混 合成1 個樣本，取大約 300-500g 放置於夾鏈袋內；若有同一塊高畦田種植兩種作 物，則將各自分成四等分進行採樣。
水稻田因其植栽過高，為避免破壞植栽，採樣方法係在田的四角用鏟子進行 採樣(圖五 C)，採樣面積為 100 cm2，深度為1 cm，此四份樣本會混合成 1 個樣本，
取大約300-500g 放置於夾鏈袋內。批次採樣間，鏟子都會用酒精以及紙巾進行擦 拭，避免土樣間交叉汙染，採集後的樣本皆保存於碎冰上避光帶回實驗室，進行 後續之分析定量。
圖五：屏東縣車城鄉及恆春鎮洋蔥田(A)、台灣大學園藝農場蔬果/香草植物田(B)、
台灣大學農藝農場水稻田(C)之土壤採樣點位
(A) (C)
(B)
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4.4.1.2 分析方法
300-500g 土壤樣本以 10 mesh 標準篩網 (2mm)過篩，以去除石頭、植物殘渣 等等非土壤物質。定量分析部分為減少土壤基質對於EMA 作用的干擾，依照方法 開發所評估的結果進行50X 土壤稀釋液製備，秤取 3 g 土壤加入 30 mL PAS (1:10) 後震盪10 sec，為 1X 土壤稀釋液，並將其以 PAS 稀釋至 50X 後，取 0.5 mL 50X 土壤稀釋液2 份，1 份不經任何處理直接進行 DNA 萃取步驟，另 1 份則加入 50 μL EMA 染劑(sigma)，使其管內 EMA 最終濃度為 2.3 μg/mL，將加入染劑後的樣本震 盪5 sec，以鋁箔紙包覆進行暗反應 5 min 後(於暗反應時需利用手上下搖晃)，置於 碎冰上並以500W 鹵素燈(OSRAM)距離 15 cm 處進行光照 20 min，光照結束後，
經EMA 染劑處理後的樣本及未經 EMA 處理樣本都將進行 DNA 萃取步驟。
經EMA 處理過後之樣本，將依照 4.3.1.5 與 4.3.1.6 之方法進行 DNA 萃取以及 qPCR 分析。而在 qPCR 之前必須 DNA 必須經過 TE buffer 進行稀釋以移除抑制物 的干擾，土壤樣本則會進行2X-20X 不等的稀釋。定量指標則參照 4.3.1.8 進行資 料處理，後續以呂氏(2010)所建立之檢量線將 DNA 量轉換成 Cells，校正土壤液稀 釋倍數和體積、土壤重量以及土壤乾溼重之後可得到土壤中活性棘阿米巴原蟲濃 度(cells/g dry wt.)以及土壤中總棘阿米巴原蟲濃度(cells/ g dry wt.)；活性比(Viable ratio)則是將土壤中活性棘阿米巴原蟲濃度除以土壤中總棘阿米巴原蟲濃度。
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