環境棘阿米巴原蟲之偵測與定量方法

分離環境樣本中棘阿米巴原蟲之傳統方法，是將樣本於前處理後放置於覆有 大腸桿菌(Escherichia coli)之非營養培養基上(non nutrient agar, NNA)，經數日培養、

分離純化等步驟之後，於顯微鏡下觀察(Booton et al., 2004)或利用 PCR(Schroeder et al., 2001)等技術進行棘阿米巴原蟲之鑑定。但是以培養搭配顯微鏡或 PCR 等方法 會有耗時、主觀判定差異以及無法提供量化數據等缺點(Qvarnstrom et al., 2006)。

在定量環境棘阿米巴原蟲上，過去文獻使用MPN 並搭配上述之培養及分離純 化方法去定量環境中的棘阿米巴原蟲(Behets et al., 2007)，仍然有耗時、操作流程 複雜(Chang et al., 2010)以及主觀判定的缺點。Qvarnstrom 等人(2006)以分子生物技 術為基礎，開發針對棘阿米巴原蟲18S rRNA gene 之 qPCR 方法，而目前也有文獻 將此方法應用於定量環境水體中之棘阿米巴原蟲(Chang & Wu, 2010；Chang et al., 2010)。然而，qPCR 雖然具有特異性、敏感性及快速等特點，但它還是有兩個缺 點，一是環境中可能有PCR 之抑制物存在，會干擾 PCR 正常放大；二是無法分辨 活菌跟死菌，造成環境中棘阿米巴原蟲濃度的高估。

環境樣本中可能含有腐植質(humic substances)或黃腐酸(fulvic acid)，這些物質 可在DNA 萃取過程中與 DNA 一起被萃取出來，並干擾 qPCR 正常放大 DNA 片段，

而影響qPCR 之定量結果(Wilson, 1997)。目前排除 qPCR 抑制物干擾之方法，包括 使用稀釋DNA (Wilson, 1997)、於 PCR 試劑中加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，其可以減輕抑制物干擾聚合酶鍵結的問題(Kreader, 1996)以及將萃 取的DNA 再次進行純化等方法(LaMontagne et al., 2002)。而 DNA 稀釋雖具有方法 簡單、不需額外繁雜步驟等優點，但是有可能會因DNA 過度稀釋而導致 DNA 濃 度低於qPCR 偵測下限(Wilson, 1997)，但實際上 DNA 稀釋應用廣泛，並證實可解 決於定量環境中棘阿米米巴原蟲時，抑制物干擾qPCR 放大的問題 (Chang et al.

2010; Chang and Wu., 2010)。

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近年來ethidium monoazide (EMA) 與 propidium monoazide (PMA)廣泛使用於 qPCR 技術當中(Bae & Wuertz, 2009；Brescia et al., 2009；Taskin et al., 2011；Varma et al., 2009；Wagner et al., 2008；Pisz et al., 2007)，這兩種核酸染劑可藉由細胞是否 完整來區別死菌與活菌，核酸染劑會進入細胞膜破損的微生物，且經由光照後與 近(範圍介於 445-485 nm)擁有較窄且平均的波長分布，且使用菲涅爾透鏡(Fresnel lens)進行光的集中，後來此 LED 系統商品化為 PhAST Blue 系統(GenIUL, Barcelona, Spain)，並應用於近期研究當中(Agustı et al., 2010；Elizaquível et al., 2012；Fittipaldi et al., 2011；Sánchez et al., 2011)。相對於鹵素燈擁有大範圍波長(300-800 nm)、產 熱、需要手動進行處理，PhAST Blue 擁有較窄的波長(464-476 nm)、不產熱以及自 動化等優點(此儀器放出的藍光最佳波長位於 465 nm 附近，而 EMA 與 PMA 核酸

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蟲滋養體，並以顯微鏡搭配23 μg/mL EMA 和 PMA 觀察經染色後的棘阿米巴原蟲 滋養體，確認核酸染劑確實進到受熱棘阿米巴原蟲滋養體當中。Fittipaldi 等人(2011) 則發現以200 μM PMA 處理 30 min 後，使用 PhAST Blue 光照 15 min 搭配 qPCR，

可區別未受熱與經121℃滅菌 20 min 之棘阿米巴原蟲滋養體與囊體。

檢視兩篇研究之間的差異可以發現，呂氏(2010)雖以 EMA、PMA 兩種核酸染 劑評估棘阿米巴原蟲滋養體之適用性，卻未測試囊體的部分；反觀Fittipaldi 等人 (2011)雖以棘阿米巴原蟲滋養體以及囊體進行測試，但只有評估 PMA，而目前尚 未有人將EMA-qPCR 或 PMA-qPCR 應用於定量環境中之棘阿米巴原蟲。另外呂氏 (2010)與 Fittipaldi 等人(2011)所開發之 EMA-qPCR 或 PMA-qPCR 方法，雖可以區 分未受熱與受熱之棘阿米巴原蟲，但若將其直接應用在土壤樣本上，可能會有基 質干擾的問題存在。Pizs 等人(2007)認為，因 EMA 帶有正電，而土壤有較多的陽 離子交換位置(cation exchange site)，此時土壤基質就會干擾 EMA 與我們想要觀察 的菌種結合，造成活菌高估的情況。.

總結上述，目前文獻雖有利用棘阿米巴原蟲滋養體以及囊體進行核酸染劑評 估，但缺少囊體對於EMA 之評估結果，且尚未有研究使用 EMA-qPCR 或

PMA-qPCR 進行環境棘阿米巴原蟲之監測，另外若要將此類技術應用於土壤樣本，

必須審慎處置土壤基質對於EMA 作用的干擾並避免出現 qPCR 之抑制作用。

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