棘阿米巴原蟲囊體核酸染劑之選擇

4.3.1.1 置備已知濃度的未受熱與受熱棘阿米巴原蟲囊體懸浮液

將培養13 日的 A. castellanii 囊體 (20 mL)，使用 2000g 離心 5 min (Riviere et al.

2006)，移除上清液後使用 10 mL PAS 清洗 1 次，之後以 5 mL PAS 回溶沉澱物，

並以血球計數器(Marienfeld-Superior, Lauda-Konigshofen, Germany)搭配 Leica DM 2500 光學顯微鏡(Lecia, Wetzlar, Germany)計算原蟲濃度(400X)以及計算囊體百分 率(92.02±0.12%)，並依此濃度使用 PAS 將原蟲濃度調整至 3×10⁴ cells/mL 共 20 mL。

將20 mL (3×10⁴ cells/mL)囊體懸浮液平均分成 10 mL，一組不進行受熱，另一組則 放入95℃水浴槽(B206, Firstek, Taiwan)進行 20 min 加熱。

囊體百分率(%)= 經血球計數器所得之囊體數

經血球計數器所得之棘阿米巴原蟲數^×100%

4.3.1.2 使用 Heat-killed E.coli NNA plate 確認未受熱與受熱囊體之活性

取50 μL 未受熱與受熱囊體懸浮液滴入 Heat-killed E.coli NNA plate 的正中間，

約60 min 後貼上封口膜(Parafilm)，置入 25℃培養箱(LTI603)，使用倒立式顯微鏡 (Eclipse TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)持續觀察 14 天(200X)並拍照，另外記錄培 養基上Clean zone 之最長直徑(cm)。

4.3.1.3 EMA 與 PMA 核酸染劑之配置

EMA (3-amino-8-azido-5-ethyl-6phenyl bromide) (Sigma-Aldrich, Taipei, Taiwan) 及PAM (3-amino-8-azido-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenyl dichloride) (Biotium, Inc., Hayward, CA, USA) 為本研究所使用之核酸染劑。冷凍乾燥型態的 5 mg EMA 以 1 mL 之 ddH2O 回溶，以 5 mg/mL 保存於-20℃。冷凍乾燥型態的 1 mg

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PMA 以 1 mL 之 20% DMSO 回溶，以 1 mg/mL 保存於-20℃。

4.3.1.4 EMA 與 PMA 核酸染劑處理

將不同濃度的EMA 與 PMA 核酸染劑各取 50 μL 加至含有 0.5 mL (3×10⁴ cells/mL)未受熱與受熱之囊體懸浮液當中，使其管內 EMA 與 PMA 最終濃度為 2.3 與23 μg/mL，震盪 5 sec 之後，使用鋁箔紙包覆樣本進行暗反應 5 min，在暗反應 期間持續用手上下搖晃樣本以確保其混合均勻。反應後再將各樣本放置距離500W Haloline ECO 鹵素燈管(OSRAM, Munchen, Germany) 15 cm 處之碎冰上光照 20 min。

光照時為避免過度光照傷害原蟲，故每隔5 min 更換放置樣本的碎冰，並用手上下 搖晃均勻混合樣本。另外，無核酸染劑處理的0.5 mL (3×10⁴ cells/mL)未受熱與受 熱囊體懸浮液，作為本實驗之對照組。

4.3.1.5 DNA 萃取

受熱與未受熱的囊體懸浮液經核酸染劑及鹵素燈處理後即進行DNA 萃取，本 研究所使用的萃取試劑為FastDNA spin kit for soil (MP biomedical, OH, USA)，依照 使用手冊上的說明萃取原蟲DNA，僅修改 Bead-beating 強度為 5.5，時間延長為 1 min，最終沖提體積為 100 μL。

4.3.1.6 Real-time quantitative PCR (qPCR)

本研究使用Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostic GmbH, Basel, Switzerland) 上進行棘阿米巴原蟲之qPCR，所選用定量棘阿米巴原蟲之引子與探針的序列皆引 用自Qvarnstrom (2006)。放大片段為 Acantheamoeba 18S rRNA gene，總長為 180-bp。

qPCR 之總體積為 25 μL，包含 10μL 樣本 DNA 或標準品、10μL LightCycler FastStart DNA Master Hybirdization Probe mix (Roche Diagnostics, Mannheim, Gremany)、0.24 μM 的前端引子 AcnatF900 (5’-CCCAGATCGTTTACCGTGAA-3’)、0.24 μM 的後端

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引子AcnatR1100 (5’-TAAATATTAATGCCCCCAACTATCC-3’)、0.24 μM 探針 AcantP1000 (5’-FAM-CTGCCACCGAATACATTAGCATGG-BHQ1-3’)以及 3.2 μL 的 ddH2O。另外每次 qPCR 分析均含有一不含 DNA，以 ddH2O 取代之控制組 (no template control, NTC)，確定批次 qPCR 之間並無遭受汙染。

qPCR 條件設定如下，起初以每秒 4.4℃的速度升溫至 95℃維持 10 min 活化 Taq polymerase 並使雙股 DNA 打開，接下來以每秒 2.2℃的速度升溫至 95℃維持 15 sec 和每秒1.1℃的速度降溫至 52℃維持 1 min 之步驟重複循環 50 次，以放大

Acantheamoeba 18S rRNA gene，最後冷卻步驟使其降溫至 40℃持續 15 sec。qPCR 結束後以Roche LightCycler 480 軟體 (Roche Diagnostics) 分析資料，利用二次微 分計算樣本和標準品的Cycle threshold (Ct)值，依據公式：Efficiency (E) = 10^(-1/slope) 計算qPCR 之放大效率(本研究放大效率為 1.99，參見附錄一)，公式中的斜率(slope) 為標準品檢量線中之斜率。

4.3.1.7 製備棘阿米巴原蟲 DNA 標準品及檢量線

棘阿米巴原蟲之DNA 標準品委外合成(Mission Biotech Co., Taipei, Taiwan)，

其步驟如下：將引子AcantF900 與 AcantR1100 進行聚合酶連鎖反應所放大棘阿米 巴原蟲18s rRNA gene 的產物(180 bp)與 yT&A cloning 載體(2728 bp) (Yeastern Biotech Co., Taipei, Taipei)進行接合作用(Ligation)，之後將載體轉殖至 E. coli DH5α 並培養於含有青黴素(Ampicillin)的 Luria-Bertani 培養基，以篩選成功轉殖表現的

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鎖反應之分析，計算得到的Ct 值則作為檢量線之 Y 軸，據此建立檢量線。

4.3.1.8 定量指標、ND 之定義及處理

將樣本於qPCR 得到的 Ct 值，以已知濃度的 DNA 標準品建立之檢量線換算 樣本的DNA 濃度(fg/μL)，再乘上 DNA 萃取中最後一個步驟的沖提體積(100 μL) 即得到DNA 量(fg)。另因標準品由 2728 bp 的 yT&A cloning 載體(Yeastern Biotech Co.)接上 Acantheamoeba 18s rRNA gene 中 180 bp 片段所組成，故所得之 DNA 量 需乘以一個校正係數(180/2908)以得到最終之原蟲 DNA 量(fg/sample)。

批次qPCR 當中，樣本 Ct 值大於 40 以上就視為未檢出(non-detected, ND)，而 在方法開發部分，ND 的樣本會以 1/2 偵測下限代入。偵測下限之計算係將 Ct 值 40 代入批次 qPCR 所建立之檢量線，經過 DNA 萃取體積以及標準品的係數校正後 得到該次qPCR 之偵測下限(fg/sample)。

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