水體

棘阿米巴原蟲濃度。空氣中濃度將另除以前測所得之IOM/MAS-100 ratio 得到校正 後空氣中活性與總棘阿米巴原蟲濃度。

4.4.3 水體

為定量水體中棘阿米巴原蟲，2012 年 9 月於台大公衛學院、護理學院、醫學 院體育館冷卻水塔進行採樣(N=6)、2012 年 10 月於台大公衛學院生物性實驗室洗 眼站進行採樣(N=4)、2012 年 11 月於迪化汙水處理廠進水管、生物曝氣池、放流 管進行採樣(N=3)、2012 年 11 月於台大農藝農場水稻田進行採樣(N=6)、2012 年 7、

11 月於台大農藝農場之農田溝渠進行採樣(N=6)。

4.4.3.1 採樣策略

冷卻水塔樣本係使用廣口採樣瓶(Sanko, Shizuoka , Japan)採集水面下 15 cm 共 1000 mL 水樣，之後加入 1 mL 10%硫代硫酸鈉中和水中餘氯，並將水樣保存於冰 桶中運送回實驗室進行分析。

生物性實驗室洗眼站樣本係將洗眼器打開之後，以血清瓶採集2000 mL 水樣，

連續放流1 min 之後再次採集 2000 mL，之後各加入 2 mL 10%硫代硫酸鈉中和水 中餘氯，直接進行分析。

廢水處理場樣本係以鐵桶懸吊進入進水管、生物曝氣池、放流管等儲槽內採 集1000 mL 水樣，之後將其倒入廣口採樣瓶(Sanko)當中，於放流管的水樣必須加 入1 mL 10%硫代硫酸鈉中和水中餘氯，並將水樣保存於冰桶中運送回實驗室進行 分析。

水稻田採樣係以自動吸量管及50 mL 離心管於農田四角採集共 100 mL 水樣，

並將水樣保存於冰桶中運送回實驗室進行分析。

農田溝渠樣本係以自動吸量管及50 mL 離心管於農田溝渠共 100-200 mL 水樣，

並將水樣保存於冰桶中運送回實驗室進行分析。

45

4.4.3.2 分析方法

冷卻水塔樣本係將1000 mL 樣本過濾於 1.2 μm RTTP Isopore membeanes (Millopore, Millipore, MA, USA) (以幫浦輕微抽氣(≦0.3×10⁵ Pa))後，將濾紙剪碎於 10 mL PAS 當中，震盪 30 秒後將濾紙取出並進行 9000g 離心 10 min，移除上清液 至1 mL 後備用。

生物性實驗室洗眼站樣本係將2000 mL 樣本過濾於 1.2 μm RTTP Isopore membeanes (Millopore) (以幫浦輕微抽氣(≦0.3×10⁵ Pa))後，將濾紙剪碎於 10 mL PAS 當中，震盪 30 秒後將濾紙取出並進行 9000g 離心 10 min，移除上清液至 1 mL 後備用。

廢水處理場進水管樣本係取500 mL 水樣以離心法(9000g, 10 min)濃縮至 10 mL 後，取 1 mL 備用；生物曝氣池樣本係取 100 mL 水樣以離心法(9000g, 10 min) 濃縮至50 mL 後，取 1 mL 備用；放流管水樣係取 1000 mL 水樣以離心法(9000g, 10 min)濃縮至 1 mL 後備用。

水稻田樣本係將100 mL 水樣以離心法(9000g, 10 min)濃縮至 5 mL 後，取 1 mL 備用。

農田溝渠樣本則是將100-200 mL 水樣以離心法(9000g, 10 min)濃縮至 10 mL，

取1 mL 備用或直接離心至 1 mL 備用。

上述各水體環境經前處理之1 mL 樣本，震盪均勻後平均分成 2 份，1 份(500 μL) 不經任何處理直接進行DNA 萃取步驟，另 1 份(500 μL)加入 50 μL EMA 染劑(sigma) 使其管內EMA 最終濃度為 2.3 μg/mL，將加入染劑後的樣本震盪 5 sec，以鋁箔紙 包覆進行暗反應5 min 後(於暗反應時需利用手上下搖晃)，置於碎冰上並以 500W 鹵素燈(OSRAM)距離 15 cm 處進行光照 20 min，光照時為避免過度光照傷害原蟲，

故每隔5 min 更換放置樣本的碎冰，並用手上下搖晃均勻混合樣本。

46

經EMA 處理過後之樣本，將依照 4.3.1.5 與 4.3.1.6 之方法進行 DNA 萃取以及 qPCR 分析。而在 qPCR 之前必須 DNA 必須經過 TE buffer 進行稀釋以移除抑制物 的干擾，各樣本將會進行2X-80X 不等的稀釋。定量指標則參照 4.3.1.8 進行資料 處理，後續以呂氏等人(2010)所建立之檢量線將 DNA 量轉換成 Cells，校正前處理 濃縮倍數以及採樣體積之後會得到水體中活性棘阿米巴原蟲濃度(cells/L)以及水體 中總棘阿米巴原蟲濃度(cells/L)；活性比(viable ratio)則是將水體中活性棘阿米巴原 蟲濃度除以水體中總棘阿米巴原蟲濃度。

47

4.5 土壤與空氣環境因子測量