滅菌土壤經過 1X-300X 稀釋後添加未受熱與受熱原蟲進行不

依據「未滅菌土壤添加未受熱與受熱棘阿米巴原蟲進行不同濃度EMA 與鹵素 燈處理」結果設計本實驗。本實驗為了排除土壤中自然存在之棘阿米巴原蟲與土 壤基質之干擾，將土壤滅菌並將土壤液進行1X-300X 稀釋，並於 1X-300X 滅菌土

壤稀釋液中添加未受熱與受熱的棘阿米巴原蟲之後進行不同濃度EMA 與鹵素燈

處理，希望能夠找出抑制土壤中添加之受熱棘阿米巴原蟲以及不影響qPCR 準確定 量未受熱棘阿米巴原蟲的土壤最佳稀釋倍數與EMA 最佳濃度，本實驗進行 3 重 複。

4.3.2.2.1 製備已知濃度的未受熱與受熱原蟲懸浮液

將培養 3 日的 A. castellanii (20 mL) 從 T75 細胞培養瓶移入 50 mL 無菌離心管，

以200 g 離心 8 min (Grimm et al., 2001)，再以 10 mL PAS 沖洗原蟲沉澱物 1 次。移 除上清液後，以10 mL 的 PAS 回溶原蟲沉澱物，再以血球計數器

(Marienfeld-Superior)搭配 Leica DM 2500 光學顯微鏡(Lecia)計算原蟲濃度(400X)，

據此濃度使用PAS 將原蟲濃度調整至 3×10⁶ cells/mL 共 10 mL。

將10 mL (3×10⁶ cells/mL)原蟲懸浮液分成 5 mL 共兩份，一份不進行受熱，另

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一份則放置於75℃水浴槽(B206)加熱 20 min，創造出細胞膜破損的受熱原蟲。

4.3.2.2.2 配置 1X-300X 土壤稀釋液

土壤採集於屏東縣車城鄉的洋蔥田，採樣深度為0-5 cm，以土鑽採集田四角 土樣並將其均勻混合，土樣重量約300-500 g。將土壤過篩(10 mesh)後，進行 121

℃滅菌20 min。取 5 g 滅菌土壤加入 50 mL PAS，此為 1X 土壤稀釋液，將 1X 土 壤稀釋液再進行10X、50X、100X、200X、300X 稀釋後備用。

4.3.2.2.3 1X-300X 土壤稀釋液之總懸浮固體測量

1X-300X 土壤稀釋液之總懸浮固體測量結果係按照環檢所 W210.57A 進行操 作，將1.5 μm 玻璃纖維濾紙(934AH, Whatman)用 20 ml 去離子水過濾 3 次，後續 抽氣10 分鐘，將濾紙放置於鋁箔紙上, 並移入 103-105℃烘箱乾燥 1 小時，待濾紙 冷卻後進行秤重並記錄重量(濾紙重複進行烘箱乾燥與冷卻至重量差少於 0.5 mg) 以確定濾紙已經完全乾燥

將1 mL (1X), 10 mL (10X、50X、100X)、20 mL (200X)、30 mL (300X)過濾至 已經過前處理完全乾燥的玻璃纖維濾紙上，過濾之後使用20 mL 去離子水沖洗 3 次, 並持續抽氣 3 分鐘，將樣本放置於鋁箔紙上, 並移入 103-105℃烘箱乾燥 1 小 時，待濾紙冷卻後進行秤重並記錄重量(濾紙重複進行烘箱乾燥與冷卻至重量差少 於0.5 mg)，樣本於濾紙上所得重量（前後濾紙差值）必須於 2.5-200 mg 之間，本 實驗進行3 重複。

總懸浮固體(mg/L) ^{濾紙後重 濾紙前重}

過濾於濾紙上 土壤稀釋液之體積

4.3.2.2.4 未受熱與受熱原蟲土壤稀釋混合液配置

取0.4 mL 1X-300X 土壤稀釋液加入 0.1 mL (3×10⁶ cells/mL)的未受熱與受熱原

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蟲懸浮液，並震盪5 sec，後續進行核酸染劑處理。

4.3.2.2.5 核酸染劑處理

將EMA 各取 50 μL 加至含有 0.5 mL (3×10⁵ cells/mL)未受熱與受熱原蟲土壤稀 釋混合液當中，使其管內最終濃度為2.3、23、46 μg/mL，震盪 5 sec 之後，使用 鋁箔紙包覆其樣本進行暗反應5 min，在暗反應期間持續用手上下搖晃樣本以確保 其混合均勻。反應後再將各樣本放置距離500W 鹵素燈管(OSRAM) 15 cm 處之碎 冰上光照20 min。光照時為避免過度光照傷害原蟲，故每隔 5 min 更換放置樣本的 碎冰，並用手上下搖晃均勻混合樣本。另外，無核酸染劑處理的0.5 mL (3×10⁵ cells/mL)未受熱與受熱原蟲土壤稀釋混合液以及無核酸染劑處理的 0.5 mL (3×10⁵ cells/mL)未受熱與受熱原蟲懸浮液 (使用 0.4 mL PAS 代替土壤稀釋液)，作為本實 驗之對照組。

4.3.2.2.6 DNA 萃取、DNA 稀釋、qPCR 及定量指標

經EMA 和鹵素燈處理過後之未受熱與受熱原蟲土壤稀釋混合液，將依照 4.3.1.5 步驟進行 DNA 萃取。為移除土壤中抑制物之干擾，DNA 樣本將使用 TE buffer 進行 5X、10X、20X 稀釋。qPCR 則依照 4.3.1.6 步驟進行。定量指標則參照 4.3.1.8 進行資料處理。

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4.3.2.3 滅菌土壤經過 10X-200X 稀釋後添加未受熱與受熱原蟲進行不同濃度 EMA