地耳草之生藥學考察

隨著社會的變遷，現代人們漸漸接受使用中草藥來達到疾病治療 及保健預防之觀念，導致中草藥需求量增加，造成藥材市場供不應 求，且因中草藥種類及來源複雜，同名異物、同物異名、代用、混用 情形普遍，以致於藥材的使用上無法一致，直接影響中藥的品質及療 效。地耳草在大陸市場上常見的偽品及混淆品有同為金絲桃科的細葉 金絲桃(Hypericum gramineum G. FORSTER)⁽¹⁵⁾ 、石竹科的蚤綴(Arenaria serpyllifolia LINNAEUS)⁽¹⁶⁾、 玄 參 科 的 直 立 婆 婆 納(Veronica avresis LINNAEUS)⁽¹⁷⁾ 以及小二仙草科的小二仙草 (Haloragis micrantha R.

BROWN)⁽¹⁸⁾，為確保用藥安全、療效均一且有效，鑑定藥材基原，辨 別藥材的真偽、摻雜和品質的優劣，可確保正確中草藥之供應源頭，

亦是監控產銷品質之良好方法，因此必須加強中草藥基原鑑定。

在中草藥基原的鑑定方面，於傳統上仍以形態學鑑定，輔以天然 物化學為基礎的理化鑑別分析，發展到分子生物細胞基因遺傳訊息方 面，從分子DNA 部分進行分析比對，鑑定方式如下分述：

一、形態學鑑別

傳統的藥材鑑定方式以形態學，即由藥材外觀以眼看、手摸、鼻 聞、口嘗等方法之五官鑑別，對其外觀性狀、內部細胞排列及內含物 之顯微鑑別來判別藥材之來源植物。具有簡單、方便、迅速的特點。

1995 年周等指出地耳草和偽品蚤綴外觀上主要的區別為地耳草全株 無毛、花黃色，蚤綴全株被細毛、花白色，顯微特徵的區別為蚤綴表 面具非腺毛、外層具厚角組織、葉肉組織中可見草酸鈣簇晶，地耳草 則無⁽¹⁶⁾；1996 年周等指出地耳草和偽品直立婆婆納外觀上主要的區別 為地耳草全株無毛、二歧聚繖花序、蒴果倒卵形，直立婆婆納全株被 細軟毛、鬆散總狀花序、蒴果廣倒扁心形，顯微特徵的區別為直立婆 婆納表面具腺毛及非腺毛、外層具厚角組織，地耳草則無⁽¹⁷⁾；1997 年 簡等指出地耳草和偽品小二仙草外觀上主要的區別為小二仙草莖上

具細小皮刺、圓錐花序、葉無透明腺點，地耳草莖上無細小皮刺、二 歧聚繖花序、葉具透明腺點，顯微特徵的區別為小二仙草具草酸鈣簇 晶，地耳草則無⁽¹⁸⁾；2004 年趙等指出金絲桃屬植物的葉片中存在分泌 細胞團和分泌囊二類形態結構特點不同的分泌結構，草本植物兩者皆 有，木本植物只有分泌囊，分泌結構在各植物葉片中的形態和分布各 具特色，可作為鑑別的依據之ㄧ⁽¹⁹⁾；2004 年陳等利用外部形態、種子 與花粉細微形態、染色體、以及生態及地理分佈等資料，進行台灣產 金絲桃屬 (HypericumLINNAUES) 植物之分類研究，以外部形態而言，

雌蕊及萼片形態為台灣產金絲桃屬植物之主要分類依據，葉片與果實 之形狀以及腺體分佈形式亦可提供良好之分類佐證，種子表面的細部 構造有助於輔助外部形態的分類結果⁽¹³⁾；2008 年宋等指出地耳草與其 混偽品細葉金絲桃外觀形態上極為相似，區別在地耳草葉片呈三角卵 形至橢圓形，細葉金絲桃葉片呈披針形至狹橢圓形⁽¹⁵⁾。

二、理化性質鑑定

在植物化學研究之基礎下，以指標成分及成分之含量作為質量控 制的模式，並隨著分析技術的進步使用的方法也越來越精進。地耳草 收載於 2005 年版的中華人民共和國藥典，關於其成分的鑑定並無記 載，為全面控制地耳草質量，利用成分作為鑑別依據有其必要性，常 作為地耳草指標成分有槲皮素(quercetin)^(20,21)、槲皮苷(quercitrin)⁽²²⁾、 異槲皮苷(isoquercitrin)⁽²²⁾等。2002 年裴等利用分光光度法測定金絲桃 屬藥用植物總金絲桃素和總黃酮的含量，比較金絲桃屬藥用植物有效 部位的含量，發現金絲桃組和地耳草組的兩種植物幾乎不含金絲桃 素，在總黃酮含量的測定中 ,所測樣品的含量在 2 % - 4 %之間⁽²³⁾。 2004 年田等利用高效液相色譜法測定地耳草中槲皮素的含量，為地耳 草及其製劑的質量控制提供了分析方法⁽²⁰⁾。2005 年祝等⁽²¹⁾及虞等⁽²⁴⁾ 進一步利用此法測定地耳草膠囊及注射液中槲皮素的含量，發現此方 法簡便、準確、重現性好,能排除其他成方的干擾,可用於該製劑的質 量控制，地耳草注射液HPLC 指紋圖譜也可用於監控地耳草注射液的

生產過程⁽²⁵⁾。 2006 年林等建立以高效液相色譜法同時測定地耳草注 糖苷(quercetin-7-O-α-L-rhamnoside)⁽³²⁾等。

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三、分子鑑定

對於形態或構造特徵不明顯、經過切片或炮製後失去特徵、親緣 關係非常接近及不同產地但品質差異性大的同種藥材等，便可以採用 分子標記之技術來鑑定中草藥之基原或品種。近年來以 DNA 為研究 基礎的分子標記技術已成功應用於多種植物，因DNA 具有訊息量大、

無發育階段不同之差異、無組織器官不同之差異、方便長期保存、可 供多次分析、試驗結果之穩定性及重複性高等優點，因此最常使用 DNA 分子標記技術作為中草藥基原鑑定之工具。DNA 分子標記是利 用生物在屬、種間，甚至個體間在基因組發生突變、缺失、插入等方 式之變異，可透過這種多態性來分析生物親緣關係。常見的分子標記 技術有 RFLP、RAPD、AFLP 及 DNA 序列比對分析等，分別如下列 所述：

(一) Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

RFLP 是發展最早的一項分子標記技術。在不同種及屬間之 DNA 序列上發生變異，利用限制性內切酶辨識特定之 DNA 而做切割，產 生不同長度及數量之 DNA 片段，再用探針進行南方墨點法顯影後即 可得到DNA 限制性片段的多態性圖譜。1993 年 Mizukami 利用 RFLP 對分佈於日本的三島柴胡的3 個地理種群進行分類學研究⁽³⁴⁾；1994 年 Yamazaki 利用 RFLP 研究 4 種甘草屬植物的系統發育關係⁽³⁵⁾；1996 年 Mizukami 得到蒼朮類 3 種植物具鑑別意義的 RFLP 指紋圖譜⁽³⁶⁾； 1997 年 Haluskova 等利用 RFLP 分析貫葉連翹之 DNA 指紋圖譜⁽³⁷⁾。 (二) Random amplification of polymorphic DNA (RAPD)

RAPD 是以 PCR 為基礎的一種分子標記技術，係利用隨機合成約 10 個鹼基長度之引子(primer)，在不同個體之 DNA 上找到多個黏合 點，再利用PCR 擴增，便因 DNA 序列發生變異而造成擴增片段大小 和數目有異，再以聚丙烯醯胺(Polyacrylamide, PAM)進行凝膠電泳反

應做判斷。2002 年 Cheng 等以 RAPD 檢測不同地區地黃(Rehmannia glutinosa)之基因相關性⁽³⁸⁾；2005 年 Ding 等以 RAPD 分子標記來檢測 及證實野生之石斛(Dendrobium officinale)基因差異性⁽³⁹⁾ ；2006 年 Smelcerovic 等利用 RAPD 比較 6 種金絲桃屬(Hypericum LINNAEUS)的 親緣關係⁽⁴⁰⁾。

(三) Amplified fragment length polymorphism (AFLP)

AFLP 是一種選擇性擴增限制性片段的方法⁽³⁶⁾，將 RFLP 及 PCR 之觀念綜合應用。利用限制性內切酶將 DNA 序列切割成小片段，再 於小片段兩端連結長度約17-24 個鹼基之已知序列 DNA (adapter)，做 為引子黏合點進行PCR 擴增，擴增產物再進行凝膠電泳反應，由 DNA 片段圖譜進行比較其差異。2002 年 Mignouna 等對四倍體非洲山藥 (Dioscorea rotundata)之 F1 以 AFLP 進行研究以便挑選育種⁽⁴¹⁾； 2003 年Gwenda 等利用 RFLP 及 AFLP 分析貫葉連翹之 DNA 指紋圖譜⁽⁴²⁾； 2007 年 Percifield 等研究金絲桃屬以 AFLP 來觀察基因差異性⁽⁴³⁾。 (四) Simple sequence repeat (SSR)

在真核生物基因組中廣泛存在簡單重複序列(simple sequence repeat, SSR)，一般是以 1-6 bp 組成較低程度的重複序列，主要以 2-3 個核苷酸為重覆單位，在不同物種間重複序列的數目有很大遺傳變 異，不同品種間亦有很大差別。在1984 年 Tautz 與 Renz 便有對 SSR DNA 報導，又根據 PCR 反應之產物不同，SSR DNA 分子標記可分為 重複序列內之產物(intra-SSR)與重複序列間之產物(inter-SSR 或稱 ISSR)兩種類型。2006 年 Yue 等以 SSR 技術分析石斛屬(Dendrobium SWARTZ )雜交種間的親緣關係⁽⁴⁴⁾；2006 年 Smelcerovic 等利用 RAPD 及 SSR 兩種方法比較 6 種金絲桃屬的親緣關係，發現畫出的親緣關 係圖有差異⁽⁴⁰⁾；2007 年 Tostain 等以 SSR 分子標記為栽培種的非洲山 藥(Dioscorea rotundata)提供有利的指紋圖譜，可用來定義其間之基因 差異性⁽⁴⁵⁾。

(五) DNA 序列測定方法

DNA 序列的變化是保守和變異共存的，不同基因在進化過程中變 異率各異，部分特定基因在種間存在適度的差異，直接對這些基因序 列進行分析亦能達到鑑別的作用。首先，需對考察對象親緣關係較近 的種之特定基因序列進行分析，建立資料庫，再將待測樣品之 DNA 序列於資料庫中進行比對鑑定。可分為下列幾種：

1.細胞核內特定 DNA 片段：

(1)ITS (internal transcribed spacer)：細胞核內 DNA 序列中包含許多重 複性基因，每個重複單元包含18S-5.8S-26S rDNA，中間由間隔區 隔開，稱為內轉錄區間(ITS)，為功能性低的 DNA 片段，演化速度 快，其屬及種間之長度及序列有高度差異，而提供有用的分子標 記。2004 年 Crockett 等分析 50 種金絲桃屬的 ITS 序列，並分析其 親緣關係⁽⁴⁶⁾ ；2006 年 Shi 等以 ITS 之結果來判斷石蒜屬(Lycoris

HERBERT )間之親緣關係，可推測其雜交來源⁽⁴⁷⁾；2006 年方利用

DNA 分子標記技術來鑑定 13 種不同來源的金絲桃屬植物種間的差 異及親緣關係，以 ITS 定序、ITS-RFLP 及 RAPD 可以漸進式的區 分同科屬內親緣接近的植物，以於快速、準確的鑑別中藥材⁽⁴⁸⁾。 (2)Adh (alcohol dehydrogenase)基因：高等植物具有兩對 Adh 基因(Adh

1、Adh 2)，又以 Adh 1 具有較大之 DNA 序列變異。

2.細胞核外特定 DNA 片段：

(1) 葉 綠 體 特 定 DNA 片 段 ： 包 括 rbcL (largesubunit of rubulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RUBISCO) 及 matK (maturase)等基因之 DNA 序列分析。2001 年 Komatsu 等分析 Panax vietnamensis 與其他人參屬的 matK 基因來鑑定其親緣關係⁽⁴⁹⁾；2007 年 Ji 等以 matK 基因序列探討 10 種石杉科石杉屬植物的親緣關係 及分子鑑定⁽⁵⁰⁾。

(2)粒體特定 DNA 片段：包括 CoxI 基因及 19S rDNA 等 DNA 定序。

亦有搭配兩種或以上的分子標記技術來做為鑑定及研究，如2007 年林等以SSR 及 AFLP 進行台灣金線連遺傳變異之簡單序列重複及限 制性內切酶片段長度多型性分析，以做為培養多醣體高含量台灣金線 連(Anoectochilus formosanus)的育種工具⁽⁵¹⁾。利用ISSR 和 RAPD 來進 行分析的有：2006 年 Guo 等對山奶草(Codonopsis lanceolata)⁽⁵²⁾及2005 年Wu 等對魚腥草屬 (Houttuynia THUNBERG) ⁽⁵³⁾的近似種間親緣關係 之研究。2004 年 Kita 等以 ITS 及葉綠體 matK 基因序列分析雪蓮

屬

的親緣關係

。

第四節 地耳草之成分

一、黃酮類Flavonoids 化合物^(54-57)

目前，研究人員己經從地耳草植物中分離得到15 個的黃酮類化

目前，研究人員己經從地耳草植物中分離得到15 個的黃酮類化