材料與方法

一、 地耳草之基原鑑定

（一）材料

本研究使用之地耳草(H. japonicum THUNB. ex MURRAY)植株，係 於2008 年 3 月，由本人採自陽明山竹子湖 (圖 4)。

（二）方法

1. 外部形態鑑別

利用五官檢查法檢視實驗之材料，並以照相方式紀錄實驗材料之 外觀影像。

2. 內部組織鑑別

利用徒手切片法對實驗材料進行切片，以橫切(transverse section, X.S.)、放射性縱切(radial longitudinal section, R.L.S.)、與切線性縱切 (tangential longitudinal section, T.L.S.)等，切取近 10 μm 之薄片檢體置 於載玻片上，先以 chloral hydrate solution 稍加熱以清除細胞內含物 後，再滴加各種不同化學試劑，如phloroglucinol solution 與 hydrochloric acid 進行木化反應；或滴加 sudan III solution 進行木栓化反應，或利用 Schultz’s 與 KOH maceration method⁽²¹⁰⁾將材料予以解離，最後以 glycerin-water(1：1)混合溶液將檢體封鎖，蓋上蓋玻片，置於顯微鏡 下，先以低倍鏡檢查其輪廓，再以高倍鏡觀察各個組織之特徵、細胞 型態及細胞內容物特徵等，並以顯微測微計測量各組織或細胞之大 小。

3. DNA 分子鑑定

A. 植物 DNA 之抽取：

將植物磨碎成細粉狀，取量接近0.1 mL。加入 extraction buffer 0.8 mL (EB)，及 0.12 mL 20% SDS，再加入適量的 PVP(小藥匙加入一匙)，

強力搖晃50 次後，接著以 65°C 水浴 10 分鐘。加入 0.4 mL potassium acetate solution，強力搖晃 50 次使之混合後冰浴 20 分鐘。以 12 krpm 轉速於4°C 下離心 20 分鐘，抽上清液 0.5 mL，加入 1 mL isopropanol 使DNA 沉澱，然後輕搖使其均勻，接著放入-20°C 靜置 5~10 分鐘。

以12 krpm 轉速於 4°C 下離心 15 分鐘，去除上清液，倒立 10 分鐘，

放在紙上使之乾燥。加入0.5 mL TE buffer (TE 比例=5：1)會有懸浮物 產生，加入0.9 mL 的絕對酒精和 0.15 mL ammonium acetate(7.5 M)，

混合液放入-20°C for 30 分鐘，增加 DNA 沉澱。以 12 krpm 轉速於 4°C 下離心15 分鐘，去上清液，直接加入 70 % EtOH，放置室溫下 15 分 鐘。以12 krpm 轉速於 4°C 下離心 5 分鐘，去上清液後再次使之乾燥 加入TE buffer(TE 比例 10：1) 0.2 mL。

B. PCR 反應

利用 PCR 複製核糖體核酸基因間隔區(ITS)，這組 ITS1-5.8S-ITS2 引子序列是：

18A: 5’- GAGGAATTCCTAGTAAGCGCGAGTC-3’

28A: 5’- ACTCGCCGTTACTAGGGGAATC-3’

PCR 放大反應條件是：1 cycle of 94℃ for 5 min, 50℃ for 1 min, 72℃ for 2 min； 40 cycles of 94℃ for 1 min, 60℃ for 1 min, 72℃ for 1.5 min, with a final extention of 72℃ for 10 min。

C. 電泳分析

將PCR 複製產物於 1% 瓊膠中進行電泳分離，在 UV 燈下觀察，

利用marker 比對，已確定此 PCR 擴增長度正確，於 700-900 bps 下 得一條明顯條帶，再將之交給源資國際生物有限公司定序。

(三) 結果分析

利用顯微攝影技術紀錄觀察結果，製作生藥組織顯微照相圖，並 以 其 ITS 序 列 ， 和 已 登 錄 於 NCBI 的 地 耳 草 序 列 作 比 對 ( 序 號 AY573025)，作為本試驗地耳草之基原依據。

1. 藥材性狀

乾燥之全草長10-40 cm，莖略呈四稜狀，單一或基部分枝，粗約 1.5 mm，外表黃褐色或暗紅棕色，易折斷，斷面中空。葉對生，無柄；

完整葉片卵圓形，全緣，葉片黃褐色或灰青色，基出脈3-5 條，皺縮，

紙質，易碎；以放大鏡觀之，有細小透明油點。聚繖花序頂生，但花 序多折斷而不完整，花萼花瓣乾縮，黃棕色，或脫落，雄蕊僅存花絲，

子房甚小，易脫落。蒴果紅棕色，長卵形，多裂成3 瓣；種子細小，

多數。氣微，味淡。(圖 5) 2. 組織構造

以顯微鏡檢視其乾燥莖之橫斷面：莖呈四方形或具四稜；表皮細 胞1層，緊貼表皮有2-3層下皮細胞，多充滿棕色內含物；皮層窄，由 3-4層排列疏鬆的薄壁細胞組成；內皮層層列明顯。維管束成環狀排 列；韌皮部窄，細胞多皺縮；木質部寬，由導管及木纖維組成；髓線 寬1列細胞。中央髓部大多中空。導管為螺旋紋和網紋導管，直徑15-25 μm；木纖維紡錘型木化，長340 μm 以上。(圖7)

3. ITS 定序比對

將定序得到的結果和NCBI中已發表的序列作比對，相似度達99%

以上，更可確定其基原。(圖6)

二、 地耳草之組織培養 (一) 材料

本研究使用之地耳草(H. japonicum Thunb. ex Murray)植株，係於 2008 年 3 月，採自陽明山 竹子湖，經外觀及顯微鑑定確認為地耳草 之基原植物地耳草(H. japonicum Thunb. ex Murray)，切取其地上部位 為培殖體，作為本試驗之材料。

(二) 試驗方法

1. 固體培養基之製備

本試驗以MS (Murashige and Skoog, 1962)基本鹽類培養基為主，

分別添加各類植物生長調節劑及各種添加物。培養基在加入凝膠物質 前，以 1 N NaOH 及 HCl 將 pH 值調至 5.70 ± 0.01，以 121 ℃、15 lb/in² (1.05 kg/cm²)之條件，高溫高壓滅菌 15 分鐘後，擺成斜面待冷卻凝固 備用。

2. 培殖體之消毒

野生地耳草地上部位以清水洗淨，於75% 乙醇中浸泡 10 秒，再 以0.5% 次氯酸鈉(每 50 mL 滴加 Tween 20 一滴)溶液消毒 7 分鐘，移 至無菌操作台後，以無菌水清洗 3-4 次至無泡沫為止，莖節去除葉片 及邊緣部分後切成約0.5 cm 長度，進行無菌苗之建立。

3. 培養環境

接種後之材料置於 25 ± 1 ℃之恆溫，於黑暗或光照(光量 100 μE/m²s，光波長 350-800 nm)環境下培養。

4. 無菌苗之建立

將進行表面消毒過後之莖節接種於不含生長調節劑之 MS 固體培 養基中，培養於100 μE/m²s 的光照環境下，經 2 週後，腋芽便會長出，

3 週後開始發根。生長之組織培養苗，供本研究後續之用。(圖 8)

4. 癒合組織之誘導

取生長5 週的植株之莖、莖節、葉作為培植體，接種於含有 1 mg/L BA 之 MS 固體培養基中，培養於黑暗條件下，經 21 天後誘導出癒合 組織，之後每10-15 天繼代一次，供探討各種不同影響因素之用。(圖 9)

6. 接種方式

植株之生長以8 x 15 cm 之錐形瓶為培養容器，內含 50 mL 培養 基，每支錐形瓶接種7 單位之腋芽。接種後於 25 ± 1 ℃，光照（每日 照光16 小時）且相對濕度為 70% 之培養室靜置培養。癒合組織培養 試驗以2.3 x 12 cm 之試管為培養容器，內含 10 mL 培養基。秤取癒合 組織 200 mg 為一單位，每支試管接種兩單位之癒合組織。接種後於 25 ± 1 ℃、黑暗且相對濕度為 70% 之培養室靜置培養。

7. 統計分析方法

各處理間之比較，係以最小顯著差異測驗法LSD (least significant difference test)判定其差異性。

三、地耳草之化學成分槲皮素(quercetin) 含量測定 (一) 材料

1. 植物組織培養法所得之地耳草植株及癒合組織。

2. 市售地耳草藥材：98 年 3 月購自台中市 XX 青草藥店。

3. 成分標準品：

quercetin 購自 Sigma 公司。

(二) 儀器

1. 高效液相層析儀(High performance liquid chromatography)：

(1)幫浦：Waters 2695 Separations Module (2)自動注入器：Autosampler 717+

(3)檢測器：Waters 2996 Photodiode Array Detector (4)分析軟體：Waters Empower software

(5) 層 析 柱 ： MERCK 公 司 LiChroCART^®254-4 HPLC- Cartridge Lichrospher 100 RP-18 (5 μm) 。 前 端 加 上 管 柱 (MERCK 公 司 LiChroCART^®4-4 Lichrospher 100 RP-18 (5 μm)，以濾除雜質。

2. 冷凍乾燥機

美國製Flexi-Dry MP。

(三) 試驗方法 1. 標準品之製備

分別稱取2 mg quercetin 之標準品，分別溶於 2 mL 70%甲醇中，

以0.45 μm (Nalgene®, New York, USA)濾膜過濾，為含量 1 mg/mL 之 母液，供HPLC 偵測 quercetin 定性定量之用。

2. 檢品之製備

材料經冷凍乾燥後，精密稱取研碎之粉末200 mg，以 5 mL 70%

甲醇經超音波震盪萃取60 分鐘後，浸泡隔夜，並以 0.45 μm 濾膜過濾，

供HPLC 檢測 quercetin 之含量。

3. 高效液相層析法 (1) 分析條件

在以甲醇(methanol)：0.1% 醋酸(acetic acid) = 55 : 45 固定比例 為流動相，柱溫25℃流速為 1 mL/min，檢測時間為 30min，檢測波長 為254 nm。

(2) 檢量線之繪製

取quercetin 之標準品，以濃度 1 mg/mL 作為稀釋母液，再分別稀

釋成母液的1、1/2、1/4、1/8、1/16 及 1/32 倍等 6 個濃度之標準品溶 液，各以0.45 μm 之微孔膜過濾，濾液用 autosampler 每次自動定量注 射10 μL 注入 HPLC 分析，每個濃度處理重複 3 次注射，將 3 次總和 平均。以濃度及積分面積各為橫座標和縱座標，利用線性迴歸分析獲 得方程式，製成標準檢量線(圖 11)。

其迴歸方程式如下：

quercetin： Y= 41503X - 1233882 r² = 0.9978

利用迴歸方程式，以波峰面積求出檢品quercetin 之含量。

(3) 檢品之測定：

將不同之地耳草檢品依上述檢品製備方法及分析條件，每次自動 定量注射20 μL 於 HPLC 分析，依檢量線迴歸方程式配合內標準法計

算quercetin 之含量。(圖 12 及圖 13)

圖4. 地耳草植物圖

圖5. 地耳草藥材圖

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control GTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACTTGCAAAAGAAGACCCGTGAACTAGTTATCAACATGTGGGGGGAGTGTTGGGAGATATCCCTTATAGCTC Sample ...

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control CTTCGTGCCAGTGGTGGGTAATCGTGTCGTTATACCGGCATGATTGACCAACATCTGGACAAGCTAACCAACCCCGGCGCGGCATGCGCCAAGGAACTTT Sample ...

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control GCAATAAATGTGGAAAACGCTA--GGTCGTTCCGAAAATCGGATAAAGCGGCCGTGTTGTGGACCACTTCTTCATTACAAAACGACTCTCGGCAACGGAT Sample ...-...CC...

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control ATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCC Sample ...

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control CGAAGCCTCTTGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACACATCGTCCCCACCGAAACAAATGCTCCTTGTAGGTGTTTGGTAAGAGGATGGGCGGATA Sample ...

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Control ATGGTCTCCCGTGCGCGGTTGCTCGCGGTTGGCCGAAAAATAAGTTCCTGGTGATAGCAAGCCATGACCAGCGGTGGTTGAAAGACCCTCGATGGGTGTC Sample ...

610 620 630 640 650 660 670 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

Control GTGAGAACTTGCATCGCATGTTGGGAGATTCTGACCTTGATCGTGTTTGAGCATATATCAAACACTCATGAA Sample ...

圖6. 地耳草 ITS 序列

圖7. 地耳草組織圖

圖8. (左) 莖節培養 2 週誘導出之側芽(中)培養 3 週之芽體 (右)培養 5 週 之側芽 (Bar = 1cm)

圖9. (左) 莖培養於 1 mg/L BA 3 週誘導出之癒合組織 (中)培養 10 天之癒 合組織 (右)培養 15 天之癒合組織 (Bar = 1cm)

圖 10. quercetin 之 HPLC 圖譜

圖11. quercetin 之檢量線

Y = 41503X - 1233882 R²= 0.9978

5×10⁷

0 0.2 0.4 0.6 0. 1 1.2

mg/mL 15×10⁷

20×10⁷ 25×10⁷ 30×10⁷ 35×10⁷ 40×10⁷ 45×10⁷

10×10⁷

quercetin

area

圖12. 市售地耳草檢品 quercetin 之 HPLC 圖譜

圖13. 組織培養檢品 quercetin 之 HPLC 圖譜 quercetin

quercetin