討論

一、地耳草芽體大量繁殖之研究

自從1902 年德國植物學家 Haberlandt 首次以人工分離培養出植物 單細胞，提出植物單細胞具有分化全能性 (totipotency) 特性的理論 後，在許多研究人員努力下，利用植物組織培養技術於短時間內使地 黃^(107,108)、浙貝母⁽¹⁰⁹⁾、當藥⁽¹¹⁰⁾、防風⁽¹¹¹⁾、人參⁽¹¹²⁾、山藥⁽¹¹³⁾、柴胡^(93-94)、

半夏^(115,116)、龍膽⁽¹²¹⁾、何首烏⁽¹²⁵⁾、庫拉索盧會⁽¹²⁷⁾等藥用植物大量繁

殖成功之報告被大量提出。一般而言，莖頂、根、根莖、莖、葉、莖 節、胚軸及種子等具有分化能力之細胞或組織皆可做為大量繁殖試驗 時的培殖體，因此，本研究以地耳草的莖、莖節及葉等部位為培殖體。

結果顯示，地耳草以莖結誘導不定芽的能力最強，達 100%，其次為 莖 66.7%，而葉片之誘導率 13.3%為最低，推測可能因莖節具含有分 生能力之側芽所致。

培養基中生長調節劑之濃度和比例會影響分化之形成。Cytokinins 類生長調節劑具有促進細胞分裂、分化及生長之作用，亦有促進側芽 生長之效果 cytokinins 有 kinetin、ZT、BA 與 TDZ，其生理作用不盡 相同，搭配不同auxins 亦會有不同的結果，對不同植物也會有不同的 影響。2006 年 Franklin 等發現添加 BA 0.5 - 2 mg/L 與 0 - 1 mg/L 之 IAA 能誘導貫葉連翹產生不定芽及擬胚⁽²³⁰⁾，2007 年 Anna 等發現貫葉連翹 的葉片培養於含1 mg/L BA 撘配 0 .5 mg/L IAA 之培養基能誘導出最

多不定芽⁽²³¹⁾。本試驗之地耳草培養於 ZT 中能誘導莖、莖節與葉片產

生大量芽體，1-4 mg/L 之 kinetins 能使未發根的不定芽再誘導出更多 不定芽。

在基礎鹽類培養基方面，一般常用的培養基有MS (Murashing and Skoog, 1962)、White (White, 1963)、LS (Linsmaier and Skoog, 1965)、

B⁵ (Gamborg et al., 1968)、N & N (Nitsch and Nitsch, 1969)、SH (Schenk

and Hildebrandt , 1972)、N6 (Chu et al., 1975)與 WPM (Lloyd & McCown, 1980)等⁽¹⁰³⁾，其中 MS 培養基中之無機鹽類離子濃度較高，為較穩定 的離子平衡溶液，較適合一般雙子葉草本植物組織培養使用，貫葉連 翹以全量 MS 基本鹽類培養基培養較適於芽體的增殖；而 WPM 培養 基中之無機鹽類離子濃度較低，一般較適合做木本植物之大量繁殖，

如日本女貞⁽²³²⁾、無患子⁽²³³⁾等藥用植物之繁殖。本研究將地耳草芽體 培養於不同基本鹽類培養基中，發現 WPM 基本鹽類培養基最適合地 耳草芽體增殖及莖的延長，推測因地耳草是濕生植物，生長的環境鹽 類濃度不高。

培養基中添加醣類的主要功能為提供植物生長所需碳源及調節 滲透壓。醣類濃度太低可能造成碳源不足而生長不佳；濃度太高則可 能導致滲透壓太大而無法生長，一般以3% 的蔗糖較適於較適於植株 的生長。但本研究結果顯示，以1% 蔗糖對地耳草不定芽生長最佳，

推測是因為地耳草是本生於濕地，土壤滲透壓不高，所以蔗糖濃度較 低較適於其生長。

二、地耳草不定芽發根之研究

全量 MS 培養基中之無機鹽類離子濃度高，較不利於植株之發 根，通常會將大量鹽類和微量鹽類濃度減半。2000 年 Pretto 等指出 1/2MS 培養基比 MS 培養基較適合貫葉連翹植株發根⁽²⁴⁶⁾； 2006 年 Franklin 等將癒合組織再生出的不定芽培養於液態 1/2MS 培養基，可 促進不定芽發根⁽²³⁰⁾。本研究將地耳草不定芽培養於不同基本鹽類培養 基及不同MS 鹽類濃度培養基中，也發現 1/2 MS 基本鹽類培養基最適 合地耳草植株之生長及發根。

適當地降低碳源濃度或增加滲透壓有時可促進發根，但醣類濃度 太低可能造成碳源不足而生長不佳，濃度太高則可能導致滲透壓太大 而無法生長。2007 年 Pavlik 指出 1%的蔗糖較 3%蔗糖利於貫葉連翹植 株的生長，可知貫葉連翹生長不需太多的養分，滲透壓較低的環境較

利其生長⁽²³⁴⁾；2006 年 Couceiro 等指出，貫葉連翹植株在光照充足的 環境下，培養於無糖培養基的植株比 3%蔗糖培養基的植株生長較好

(235)。本研究結果顯示，果糖不適合做為地耳草的碳源，3% 蔗糖及葡

萄糖皆利於地耳草植株地上部生長，但 3%蔗糖較利於其發根及側芽 生長；而以濃度5% 的蔗糖對地耳草的發根及植株生長最有利。

Auxin 類植物生長調節劑及部分 cytokinin 類常用來植物體發根、

誘導細胞分裂、細胞生長及細胞組織分化來達到特殊目的。2002 年林 發現添加NAA 可使促進首烏不定芽發根，但馴化的存活率降低⁽¹²⁵⁾； 貫葉連翹的不定芽常用IAA 及 IBA 來誘導其發根^(230,231)。本研究以添 加1 mg/L kinetin 之培養基，能使地耳草植株發展出最完整的根系。

三、地耳草癒合組織培養之研究

利用植物細胞生產二次代謝產物，要先以培殖體誘導癒合組織。

1977 年 Murashige 認為培殖體選擇須考慮取材部位、培殖體大小、培 殖體年齡及採樣季節等⁽¹⁴⁶⁾，因此培殖體的選擇對實驗系統的建立有很 大的影響。除了培殖體的影響外，植物生長調節劑是誘導癒合組織的 另一重要因子，一般以auxins 與 cytokinins 類搭配使用。2000 年 Pretto 等發現以貫葉連翹之葉片為培殖體，以1 mg/L 2,4-D 搭配 1 mg/L BA 之培養基能誘導出最多癒合組織⁽²³⁶⁾； 2005 年 Gadzovska 等發現高濃 度(3-5 mg/L)的 BA 能誘導貫葉連翹莖節產生癒合組織⁽²³⁷⁾；2005 年 Pan 等將貫葉連翹種子於無菌環境下發芽，並將其胚軸培養於1 mg/L NAA 搭配0.5 mg/L BA 之培養基來誘導癒合組織產生⁽²³⁸⁾；2006 年 Franklin 等用2 mg/L BA 加 0.5 mg/L IAA 之培養基誘導貫葉連翹之根、莖、

葉產生癒合組織⁽²³⁰⁾；2007 年張等用 0.6 mg/L NAA 加 0.1 mg/L kinetin 之培養基誘導元寶草的葉片產生鬆軟的癒合組織⁽²³⁹⁾。本研究使用 1 mg/L BA 之培養基，以葉片、莖及莖節為培殖體進行癒合組織誘導，

結果顯示各部位之培殖體皆可產生癒合組織，但以莖節有最高的誘導 率，可達到100%。

在培養環境中，光照的主要作用並不是供給植物行光合作用以產 生營養，而是對植物生長及分化的刺激或誘導的因素。1984 年 George 與Sherrington 報導指出對於植物的生長應給予適當的光照，但對於誘 導癒合組織方面，多以黑暗環境為佳⁽¹⁷⁷⁾。2002 年郭指出將延胡索癒 合組織置於暗培養下進行繼代增殖，可得細胞色澤鮮黃、質地均勻緊 密之癒合組織，而光照下之癒合組織細胞鬆散⁽²⁴⁰⁾。本研究結果顯示第 耳草癒合組織培養於黑暗中，可獲得質地緊實、黃色色澤之癒合組 織，而在提供光源培養下的癒合組織則呈現綠色。

在基礎鹽類培養基方面，一般常用 MS 培養基做貫葉連翹癒合組 織的培養與繼代；元寶草較適合培養於 1/2 MS 培養基⁽²³⁹⁾； 2008 年 張指出全量MS 基本鹽類培養基對粉防己癒合組織較為有利⁽²⁴¹⁾。本研 究將地耳草癒合組織培養於不同基本鹽類培養基及不同MS 鹽類濃度 培養基中，發現全量 MS 基本鹽類培養基最適合地耳草癒合組織之生 長。

不同植物的癒合組織所需的碳源不盡相同，依植物的不同滲透壓 的需求亦不同。醣類濃度太低可能造成碳源不足而生長不佳；濃度太 高則可能導致滲透壓太大而無法生長。2008 年張指出於培養基中添加 3%蔗糖最適合粉防己癒合組織生長⁽²⁴¹⁾。本研究結果顯示，以 3%蔗糖 或葡萄糖對地耳草癒合組織生長最佳，果糖不利於地耳草癒合組織生 長，因蔗糖高溫高壓加熱後部分會分解成葡萄糖和果糖，推測地耳草 細胞較偏好使用葡萄糖；雖然培養於1% 蔗糖的癒合組織因滲透壓較 低使其一開始生長較為快速，但養分也較早使用完，使其在第七到八 天便生長停滯。

固體培養基必須使用凝膠物質來固化培養基，一般常用的有 gelrite 及 agar，但因其中含有多種不明成分之生理活性物質，因此添 加的種類及濃度高低常影響植物生長。2002 年 Tsao 與 Reed 指出在懸 鉤子屬(Rubus)葉片誘導癒合組織之培養基中添加適當植物生長調節 劑，並以0.71% agar、0.19% gelrite 及混合 0.35% agar 與 0.11% gelrite

之不同凝膠物質做試驗，結果顯示以0.19% gelrite 做為凝膠物質可獲 得較高的癒合組織誘導率⁽²⁴²⁾。2007 年張指出粉防己癒合組織在 0.9%

agar 濃度培養基中生長最好⁽²⁴¹⁾。本研究以添加 gelrite 為凝膠物質且濃 度為 0.3% 之培養基對地耳草癒合組織之生長情形較佳，gelrite 濃度 增加使硬度增加，較不利於癒合組織養分的吸收，使培養於 0.6%

gelrite 的癒合組織生長較緩慢或較易褐化。

植物生長調節劑為控制植物生長和分化的重要因子，因此在培養 基中，添加適量植物生長調節劑，可以誘導細胞分裂、細胞生長及細 胞組織分化來達到特殊目的。2000 年 Pretto 等將貫葉連翹的癒合組織 繼代至1 mg/L BA，能誘導最多不定芽⁽²³⁶⁾；2003 年 Pasqua 等以 1 mg/L IBA 搭配 0.2 mg/L BA 使貫葉連翹懸浮細胞再生不定芽⁽²⁴³⁾；2005 年 Pan 等用 1 mg/L TDZ 誘導貫葉連翹癒合組織再生芽體⁽²³⁸⁾；2006 年 Franklin 等以 1 mg/L IAA 搭配 0.5 mg/L BA 貫葉連翹癒合組織芽體 30 天後，再移植至不含生長調節劑的MS 培養基，可使不定芽生長⁽²³⁰⁾。 本研究將培養於1 mg/L BA 之地耳草癒合組織，繼代至 0.1 mg/L BA 之培養基，能使癒合組織再生最多不定芽。將 BA 的濃度提高並不會 促進地耳草癒合組織的生長，將 BA 濃度降低或移除 BA，不定芽便 會產生，此癒合組織的形態和芝麻胚性的癒合組織⁽²⁴⁴⁾極為相似，推測 本實驗用 BA 誘導及繼代的癒合組織也具胚性，非真正的癒合組織，

而比較類似擬胚的構造。

四、地耳草植株及癒合組織成分之測定

1989 年 Yazaki 與 Okada 指出 Cornus officinalis 以光照進行培養，

雖有助於懸浮細胞生長，但卻抑制 tannin 的生成⁽²⁴⁵⁾。2002 年 Harsh 指出培養於黑暗的貫葉連翹懸浮細胞較光照培養者利於 hypericin 生 成。而本實驗地耳草癒合組織卻培養於光照下較利於quercetin 的生成

(246)。

在培養基中所含營養成分、離子濃度及不同滲透壓皆對細胞生長 及二次代謝產物合成有關，2000 年闕指出雖然 B₅培養基有助於台灣 龍膽癒合組織生長增殖，但所測之gentiopicroside 與 swertiamarin 含量 極低，在考量二次代謝物前提下，仍以採用MS 培養基為宜⁽¹²¹⁾。1990 年Ikata 與 Itokawa 指出 3% glucose 或 3% maltose 對黃連生產 berberine

在培養基中所含營養成分、離子濃度及不同滲透壓皆對細胞生長 及二次代謝產物合成有關，2000 年闕指出雖然 B₅培養基有助於台灣 龍膽癒合組織生長增殖，但所測之gentiopicroside 與 swertiamarin 含量 極低，在考量二次代謝物前提下，仍以採用MS 培養基為宜⁽¹²¹⁾。1990 年Ikata 與 Itokawa 指出 3% glucose 或 3% maltose 對黃連生產 berberine