第三章 材料與方法
3.2 實驗方法
3.2.2 測定交聯度
3.2.3.3 坐骨神經神經導管接合術
大鼠消毒完成後，術者先以拇指及食指找到大鼠右側之股骨頭上大 轉子(greater trochanter of femur)及外側豆狀骨(lateral fabella)予以定位，
並用刀片沿此兩點之連線劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌(biceps femoris muscle)與筋膜，遊離出長約 2.5 cm 的坐骨神經，在距梨狀肌(piriformis)
下緣 8 mm 處，用剪刀整齊剪斷坐骨神經幹，取出已滅菌之神經導管，
以9-0 Nylon 縫線於神經導管後端 1.0 mm 處孔洞入針，然後再穿過一方 斷端之神經外膜，接著自神經導管後端 1.0 mm 另一處孔洞穿出，最後 於神經導管外以單結固定，經多次事前的縫合試驗證實，斷端神經會滑 至兩端外側孔洞位置，而製造10 mm 的間距。
神經與神經導管縫合完畢後，將麻醉劑之流量改為 1 litter/kg．min，
並以4-0 Catgut chrom 縫合肌肉及皮膚。手術完畢後，測量大鼠體重，
並 將 大 鼠 置 回 籠 子 ， 照 光 維 持 體 溫 ， 等 待 動 物 甦 醒 。 以 抗 生 素 Pamoxicillin®(內含 Amoxicillin Trihydrate 1.5 gm/60ml，聯邦化學製藥股 份有限公司，Taiwan)1 g 溶解於 100 ml 逆滲透水中，當作二天份之水給 予自由飲水，預防傷口感染。
3.2.3.4 再生神經組織切片評估
大鼠犧牲後，將神經導管內再生的神經組織連同神經導管取下，浸 泡於 2.5%glutaraldehyde 水溶液三天，取出內有再生神經組織之神經導 管，將其等分為三等分，利用刀片分別去除前後三分之一，留下中間三 分之一的部分置於 2.5%glutaraldehyde 水溶液中，再將再生神經組織以 含2.5%glutaraldehyde、4%Paraformaldehyde 及 0.1 M cacodehyde 混合液 固定約 1~2 日，隨即將神經以 1%OsO4 後固定約二小時，之後，以
50~100%酒精脫水，再以樹脂包埋，並將含再生神經組織之樹脂置入 60~70℃烤箱中約 16 小時，待樹脂硬化。隨後將包埋之再生神經組織作 橫向1 μm 切片後，以 Toluidine blue 染色，當組織切片染色後，髓鞘與 Schwann cell 會明顯呈色。將再生神經組織切片以接於顯微鏡（Zeiss HAL 100, Germany）的數位相機（Nikon Coolpix 950, Japan）拍下數位影像。
3.2.3.5 組織研磨，萃取蛋白質
將取下之再生神經先用 PBS 清洗乾淨，去除殘留在組織上的毛及未 完全降解之神經導管材料，洗淨後用吸水紙吸掉神經及剪刀上的多餘的 PBS。用剪刀將組織剪為小片段，置於 1 ml eppendorf tube 中，在 eppendorf 中加入200μl tissue lysis buffer，震盪均勻。
依序用 75％酒精及 PBS 清洗組織研磨器之刀頭，清洗完後用拭鏡紙 擦拭刀頭。
將裝有神經組織之eppendorf tube 置於裝滿碎冰的小燒杯中進行組 織研磨，每次研磨時間不宜太長（過程中不時vortex 均勻），磨至 eppendorf 中的 lysis buffer 呈乳白色，且顏色不再加深為止。從最後一管 研磨完成時開始計時，置冰上20 分鐘。
將研磨過之組織進行超音波震盪，每管組織震盪 10 次，每次 10 秒，
然後於4℃離心，12000 rpm，40 分鐘。離心後吸取上清液至新的 1 ml
eppendorf tube，若上清液中仍有白色懸浮物，則可以再次離心 20 分鐘 至40 分鐘。將所萃取出之蛋白質至於-80℃冰箱保存。
3.2.3.6 蛋白質定量
將萃取出的蛋白質以二次水做適當稀釋，同時以 Bovine Serum Albumin（BSA）做為蛋白質標準曲線之標準品，濃度分別稀釋成 0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml。再分別加入 250 μl Lowery reaction buffer 於 標準品及樣品中，室溫下作用 5 分鐘，接者分別取 200 μl 至 96 孔盤，
以750 nm 波長測定吸光值，再利用內插法求出樣品的蛋白濃度。
3.2.3.7 西方墨點法
取同樣重量的蛋白質樣品，各加入3 μl 6×loading dye，用 PBS 補至 相同總體積；再將樣品置於100℃ denature 5 分鐘，即可進行 SDS-PAGE 電泳分析。SDS-PAGE 上層膠為 4％之 stacking gel，下層膠為 8-15％（依 所預測之蛋白質分子量大小決定）之separating gel。把 denature 過的蛋 白樣品loading 至上層膠的 U 型槽中，以 running buffer 跑膠 75V、2 小 時。電泳結束即進行轉漬（transfer），以 transfer holder 白色部分為底部，
逐一平鋪浸濕之菜瓜布、Whatman 3M 濾紙、預先以甲醇浸溼的 PVDF 膜、下層膠（separating gel）、Whatman 3M 濾紙、菜瓜布，在 4℃下以 100V 進行轉漬 90 分鐘。轉漬完後，取出 PVDF 膜並加入 blocking buffer 室溫下shaking 1 小時；再加入 1 級抗體於 4℃下反應整夜；接著以 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15-20 分鐘。最後加入 2 級抗體室溫下 反應1 小時，同樣以 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15-20 分鐘；
最後以ECL kit 於冷光數位分析儀器進行冷光呈色反應。