不同材料神經導管中周邊神經再生情形及相關蛋白質表現評估;Evaluation of Regenerated Nerves and Their Protein Expression in Three Different Conduit Materials

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(1)中國醫藥大學中國醫學研究所碩士論文編號：GICMS-340. 指導教授：賴東淵. 博士. 共同指導教授：陳悅生. 博士. 論文題目. 不同材料神經導管中周邊神經再生情形及相關蛋白質表現評估 Evaluation of Regenerated Nerves and Their Protein Expression in Three Different Conduit Materials. 研究生：陳力殊. 中華民國九十八年六月二十二日.

(2) 目第一章. 錄. 前言 .................................................................................................1. 1.1 研究背景.......................................................................................1 1.2 神經導管接合術...........................................................................1 1.3 研究動機及目的 ...........................................................................3 第二章. 文獻探討 .........................................................................................6. 2.1 周邊神經損傷 ...............................................................................6 2.1.1 周邊神經損傷的原因 ............................................................6 2.1.2 周邊神經損傷的分類 ............................................................6 2.1.3 神經損傷後之變化 ................................................................8 2.1.4 周邊神經再生 ........................................................................9 2.1.5 周邊神經斷傷的修補技術 ..................................................10 2.2 神經導管接合術 .........................................................................13 2.2.1 與神經導管接合術相關的研究主題 ..................................13 2.2.2 矽膠管內神經再生之細胞學變化 ......................................13 2.2.3 神經導管之研發現況回顧 ..................................................18 2.2.4 降解性生醫材料交聯劑的選擇 ..........................................19 2.2.5 理想降解性神經導管之要件 ..............................................20 2.3 組織與生醫材料之交互作用 .....................................................20 2.4 明膠.............................................................................................21 2.4.1 來源與萃取 ..........................................................................21 2.4.2 特性 ......................................................................................22 2.4.3 組成成分 ..............................................................................22 2.4.4 化學結構 ..............................................................................22 v.

(3) 2.4.5 Bloom number ......................................................................24 2.4.6 明膠的應用 ..........................................................................25 2.5 1-ETHYL-3-(3-DIMETHYLAMINOPROPYL)CARBODIIMIDE (EDC) ...26 2.6 梔子與綠梔子素 .........................................................................28 2.6.1 梔子 ......................................................................................28 2.6.2 綠梔子素(genipin) ...............................................................34 2.7 周邊神經再生之相關蛋白質 .....................................................38 2.7.1 Synapsin Ι .............................................................................38 2.7.2 GAP-43（growth associated protein 43） ..........................39 2.7.3 TGF-β1(Transforming growth factor-β1) ..............................41 2.8 神經損傷的中醫觀點 .................................................................43 2.8.1 神經系統在中醫學中的定位 ..............................................43 2.8.2 周邊神經斷傷與相關之中醫病證 ......................................44 第三章. 材料與方法 ...................................................................................46. 3.1 主要材料.....................................................................................46 3.1.1 製造神經導管 ......................................................................46 3.1.2 動物實驗 ..............................................................................47 3.1.3 組織研磨 .............................................................................48 3.1.4 西方墨點法 .........................................................................48 3.2 實驗方法.....................................................................................50 3.2.1 製造神經導管 .....................................................................50 3.2.2 測定交聯度 .........................................................................52 3.2.3 動物實驗 .............................................................................54 3.2.3.3 坐骨神經神經導管接合術 ...............................................54 vi.

(4) 第四章. 結果 ...............................................................................................58. 4.1 神經導管 .....................................................................................58 4.1.1 神經導管規格 ......................................................................58 4.2 神經導管接合術實驗 .................................................................61 4.2.1 觀察實驗大鼠外觀之變化 ..................................................61 4.2.2 再生組織長過 10 mm 間隙之成功率.................................64 第五章. 討論 ...............................................................................................80. 5.1 神經導管規格 .............................................................................80 5.2 神經導管接合術實驗 .................................................................82 5.3 組織切片與神經再生相關蛋白質表現量結果分析.................83 第六章. 結論 ...............................................................................................90. 參考文獻………………………………………………………………….. 91 英文摘要………………………………………………………………….105 謝辭……………………………………………………………………….106. vii.

(5) 圖目錄圖 2.1 明膠單體結構 .................................................................................23 圖 2.2 明膠結構鏈 .....................................................................................23 圖 2.3 明膠分子鏈結構 .............................................................................23 圖 3.1 NINHYDRIN 與自由胺基的反應機制 ..............................................53 圖 4.1 ENG 神經導管肉眼外觀.................................................................58 圖 4.2 GGC 神經導管肉眼外觀 ................................................................59 圖 4.3 足趾的斷裂與變形..........................................................................62 圖 4.4 SILICONE 組之再生神經切片，放大倍數 40×...............................65 圖 4.5 SILICONE 組再生神經切片，放大倍數 100×.................................66 圖 4.6 SILICONE 組再生神經切片，放大倍數 400×.................................66 圖 4.7 ENG 組之再生神經切片，放大倍數 40× .....................................67 圖 4.8 ENG 組之再生神經切片，放大倍數 100× ...................................68 圖 4.9 ENG 組之再生神經切片，放大倍數 400× ...................................68 圖 4.10 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 40× ...................................69 圖 4.11 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 100× .................................70 圖 4.12 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 400× .................................70 圖 4.13 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 40× ...................................71 圖 4.14 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 100× .................................71 圖 4.15 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 400× .................................72 圖 4.16 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 40× ...................................72 圖 4.17 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 100× .................................73 圖 4.18 GGC 組之再生神經切片，放大倍數 400× .................................73 圖 4.19 三種神經導管中再生神經之 SYNAPSIN Ι 表現量.......................74 viii.

(6) 圖 4.20 三種神經導管中再生神經之 SYNAPSIN Ι 表現量統計分析.......75 圖 4.21 三種神經導管中再生神經之 GAP-43 表現量............................76 圖 4.22 三種神經導管中再生神經之 GAP-43 表現量統計分析 ...........77 圖 4.23 三種神經導管中再生神經之 TGF-Β1 表現量 .............................78 圖 4.24 三種神經導管中再生神經之 TGF-Β1 表現量統計分析.............79. ix.

(7) 表目錄表 2.2 BLOOM NUMBER 與 MOLECULAR WEIGHT .......................................24 表 3.1 抗體資料..........................................................................................49 表 4.1 ENG 神經導管交聯度測試基本資料.............................................59 表 4.2 GGC 神經導管交聯度測試基本資料.............................................60 表 4.3 大鼠外觀變化基本資料..................................................................63 表 4.4 三組大鼠神經管內之白色再生管狀物..........................................64 表 4.5 三組大鼠的再生成功率 .................................................................64 表 4.6 三種神經導管中再生神經之 SYNAPSIN Ι 表現量比較..................75 表 4.7 三種神經導管中再生神經之 GAP-43 表現量比較 ......................77 表 4.8 三種神經導管中再生神經之 TGF-Β1 表現量比較 .......................79. x.

(8) 不同材料神經導管中周邊神經再生情形及相關蛋白質表現評估研究生：陳力殊指導教授：賴東淵博士中國醫藥大學中國醫學研究所. 可降解性之生醫組織材料具有不需二次手術取出以免傷害神經之優點，故用於製作神經導管僑接周邊神經可使臨床後遺症減少。在眾多可降解性之生醫組織材料中，明膠為膠原蛋白之二級結構破壞後的產物，具便宜、抗原性低及毒副作用低等優點。本實驗以從中藥梔子萃取之梔子素 (ginipin) 及 EDC/NHS 〔1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/ N-hydroxysuccinimide〕二種不同交聯劑交聯而得的明膠管作為可降解性神經再生導管的材料（分別稱之為 GGC 導管及 ENG 導管），並以非降解性之矽膠管做對照，將三種導管殖入大鼠被截斷之坐骨神經之間，手術八週後，以組織切片評估三種神經導管對神經生長功能的影響；並同時取再生之神經組織，經研磨分離出蛋白質後，以西方墨點法分析在神經再生過程中會大量表現之蛋白質 synapsin Ι、GAP-43 以及和組織纖維化相關的 TGF-β1 之表現量，嘗試以分子角度評估導管材料的好壞。組織切片結果顯示，矽膠管組大鼠的再生神經成熟度最佳，ENG 組次之，GGC 組最差。蛋白質分析結果，三組之 synapsin 及 GAP-43 表現量皆以矽膠管組最多，ENG 組次之，GGC 組最少，和組織切片之結果相符合；TGF-β1 之表現量則呈現 ENG 組最多，GGC 組次之，矽膠管組最少，此結果則無法單就組織切片中纖維疤痕組織之厚度做解釋。. 關鍵字：周邊神經再生、降解性神經導管、明膠、綠梔子素、西方墨點法 1.

(9) 第一章. 前言. 1.1 研究背景隨著工業生產機械化程度的提高和交通事業的發展，神經損傷的發生率有大幅上升的趨勢，根據美國的統計，在急診室的創傷患者中，約 2.8%合併有周邊神經的損傷。雖然周邊神經具有再生的能力，但神經再生牽涉到一連串很複雜的生理反應，若不加以處理，其復原的情況皆不佳，故目前研究的方向在於如何使神經的修復與再生結果更好，即能夠縮短再生時間，擴大再生間距，提高再生神經的成熟度，促進神經功能恢復。. 1.2 神經導管接合術周邊神經斷傷時，神經斷端間隙的距離是選用何種神經接合術之最重要考慮因素。當斷端間距較長時，神經縫合便不適用；而用自體神經移植的方法又有神經移植段取得困難的問題，所以此時神經導管接合術為值得考慮選用的方法。所謂神經管接合術即將兩神經斷端分別縫於神經管之兩端，以利神經生長復原。其優點包括防止神經生長路線被其他組織阻擋、避免不利神經生長的物質近入管內、導引再生神經正確的生長方向及將神經斷端產生的神經生長因子侷限於管內避免擴散等等。. 1.

(10) 用來做為神經管的材料包括生物性材料（例如血管[1]、膠原蛋白等 [2]. ）及人造材料（例如矽膠管[3]、Urethane[4]等）。為了提供神經更好的. 生長環境，許多實驗室試著在神經管內填充各種幫助神經生長的物質，包括 Schwann cell、Fibroblast、Fibrin、Laminin、Collagen、NGF[5, 6]、 Ginsenoside Rb1[7] 以及 Bilobalide[8] 等等，或是藉由改變神經管的通透性，以利神經再生初期的廢物排除[9]。若以神經管材料在體內能否被分解來區分，可分為不可降解性材料及降解性材料。前者被應用的最廣泛的是矽膠管[3, 5, 7, 8]，後者則包括膠原蛋白（collagen）[2]、明膠（gelatin）[10-12]、等等。可降解性之生物組織材料具有不需二次手術取出以免傷害神經之優點，但因為其在體內會受到免疫系統及酵素攻擊而隨著時間被分解，所以在植入動物體內前，需經過交聯劑處理增加材料結構的化學鍵結，以增強材料對酵素攻擊的抵抗能力，減緩被分解的速度，使得神經管能在神經再生的過程中提供足夠的支持力。目前常用的交聯劑，主要是以化學方法合成的化學交聯劑，如戊二醛(glutaraldehyde)等，但是以戊二醛交聯處理的生物膠在臨床應用方面，常會出現組織硬化、鈣化及纖維化等問題，其與戊二醛的毒性過高有關[13]。水溶性的 carbodiimide 是另一種常被使用的交聯劑，其中又以 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-cabodiimide (EDC)被使用的最多[14]。. 2.

(11) 因為其特別的作用機制，使 carbodiimide 本身在交聯作用完成後，並不會存在生物組織之間，故能有效的減低組織鈣化的問題。近年來，很多研究者致力於尋找毒性低的天然交聯劑。Sung[15]等在 1998 年從中藥梔子果實中，萃取出一種天然的交聯劑－綠梔子素(genipin)，來交聯處理生物組織材料。Yamazaki[16] 等在實驗中發現綠梔子素跟神經生長因子 (nerve growth factor, NGF)一樣，都有引發 PC12 細胞株神經突分化的作用，且神經突突出的長度，隨著其濃度的上升而有增加的趨勢。本實驗室曾個別嘗試過以梔子素交聯明膠製成神經導管(GGC)[11]，以及用 EDC 交聯明膠製成神經導管(ENG)[12]，植入大鼠坐骨神經 10 mm 斷端間，術後飼養 4~12 週，觀察坐骨神經再生情形，ENG 導管及 GGC 導管均能幫助再生神經成功生長過 10 mm 間隙，但這兩個實驗留下了一些問題有待探討，將於 1.3 節詳述。. 1.3 研究動機及目的本實驗室在嘗試使用 ENG 及 GGC 為神經導管材料時，並無非降解性材料作為對照，但是和使用矽膠管為神經導管材料的其他實驗相比，恢復週數相同的條件下，矽膠管內的再生神經成熟度似乎仍較佳，而實驗結果發現，兩種降解性神經導管材料無可避免的會誘發免疫反應，使再生神經周圍產生纖維組織，這是否就是 ENG 及 GGC 內再生神經成熟 3.

(12) 度不如矽膠管的唯一原因？抑或是這兩種材料也影響了神經再生過程中的其他機制？再者，同為降解性導管，ENG 及 GGC 的差別只在於交連劑的不同，而比較當時兩個研究的實驗結果顯示，GGC 內的再生神經相較於 ENG 有生長遲滯的現象，這究竟是實驗操作造成的誤差抑或是材料本身造成的差異？若是材料造成的差異，究竟在整個神經再生過程的哪個環節造成了這些差異？為了回答上述問題，我的實驗除了 ENG 及 GGC 兩種材料，也加入了矽膠管這個非降解性材料，將三種材料一起進行比較。此外，除了以組織學切片評估再生八週時的再生神經成熟度，也嘗試從神經再生過程中的重要步驟找出相關的蛋白質，藉由偵測這些蛋白質的表現量來解釋不同神經導管材料所造成的差異。周邊神經斷傷後，斷傷處近端新生軸突萌芽(axonal sprouts)的產生、再生軸突生長(regenerating axon outgrowth)及突觸形成(synapse formation) 是決定再生結果很重要的因素。針對此一過程，我選擇了 GAP-43 及 synapsin Ι 兩個蛋白質做偵測。GAP-43 及 synapsin Ι 為神經特有的蛋白質，二者均會在發育及再生中的軸突尖端生長錐(growth cone)處被大量表現。synapsin Ι 和軸突的延長(axonal elongation)與突觸的形成有關； GAP-43 則可反應再生神經萌芽的數目(number of sprouts)及生長錐生長. 4.

(13) 延伸(growth cone extension)的能力。Das[17]等證實，在嗜鉻細胞瘤細胞株 (PC12 cell line)受神經生長因子(NGF)刺激產生突起時，GAP-43 及 synapsin Ι 的表現量均會上升；Haastert[18]等則在大鼠坐骨神經截斷並以矽膠管橋接的神經再生實驗中，分別以 GAP-43 評估軸突再生情況， synapsin Ι 評估新生突觸成熟度。此外，降解性的材料因會引起較強且持續的發炎反應，所以再生神經外膜之外常有纖維組織出現，阻礙周邊神經再生。TGF-β 是傷口癒合過程中，參與組織纖維化及疤痕組織(scar tissue)形成的重要細胞激素，故我選擇偵測 TGF-β 去評估三種不同神經導管材料引發纖維疤痕組織產生之嚴重程度。綜上所述，本研究欲在同樣實驗條件下，比較 ENG 及 GGC 對神經再生的助益效果，並加入一組不可降解性材料（矽膠管）做為對照。除了組織切片評估外，同時進行西方墨點法蛋白質分析，針對與神經再生相關之蛋白質 synapsin Ι、GAP-43 及 TGF-β1 比較三種不同神經導管的差異，以評估三種不同神經導管材料用於神經導管接合術之生物適用性。. 胞内信号，可大大增强与 G 蛋白偶联的受体转运作用。. 5.

(14) 第二章. 文獻探討. 2.1 周邊神經損傷 2.1.1 周邊神經損傷的原因周邊神經損傷的原因可分為物理、溫度、缺血、化學等因素，而大部份多歸於物理性因素。物理性受傷機轉為擠壓，牽拉或切斷。. 2.1.2 周邊神經損傷的分類神經損傷的分類有多種方式，有依病因，也有依據神經纖維的組織結構與功能的改變來分類[19, 20]。 2.1.2.1 Sedden 分類法 1943 年 Sedden，將神經損傷的區分三個不同程度[21-23]：神經失用(neurapraxia) 在連續的軸突內有局部傳導阻斷的現象，而神經的應激性仍然保存。此損傷相當於擠壓受傷後產生的急性局部去髓鞘的阻斷。傳導阻斷持續幾星期或幾個月，直到局部髓鞘修復。軸突斷傷(axonotmesis) 軸突受傷而喪失連續性，神經內膜(endoneuriμm)仍然完整。發生於神經受擠壓或拉傷後，軸突的連續性破壞，使軸突的遠端會產生 6.

(15) Wallerian 退化(Wallerian degeneration)。神經功能恢復的時間長短取決於軸突再生時再支配(reinnervation)原來的目標組織的時間。軸突斷傷後，軸突可延著原本的途徑再生，再支配原本的目標組織，所以預後良好。神經斷傷軸突斷傷外，神經幹連續性的部分或全部的喪失。神經幹的非軸突部份包括神經內膜，周邊神經膜以及神經外膜。神經斷傷包含了神經的斷離。神經斷傷須要手術修復。此神經功能恢復的預後不佳。 2.1.2.2 Sunderland 分類 Sunderland 根據神經幹不同組織受傷之程度做了更詳細的分類 [24, 25]. 。Sunderland 將神經損傷分為五個階段。第一型與第二型相當於 Sedden. 的神經失用和軸突斷傷。Sunderland 將嚴重的神經損傷加以細分，依各別結締組織的連續性與否再細分三型。第三型為軸突與神經內膜的喪失但是圍神經膜依然完整。第三型會產生軸突 Wallerian 退化以及神經束的紊亂。第四型意指圍神經膜的連續性喪失但神經外膜仍完整。第五型為神經幹完全斷離。本研究所採用之實驗動物模型屬於第五型之神經損傷。. 7.

(16) 2.1.3 神經損傷後之變化軸突斷傷後，神經會產生退行性的變化。 2.1.3.1 遠端的軸突部份產生 Wallerian 退化，從損傷處向遠端軸突進行。初期，軸突腫大，軸突內細胞質微細管和神經絲產生蛋白水解，而呈現顆粒狀。繼之軸突變成碎片，並被巨噬細胞(macrophage)吞噬。另外，具髓鞘化軸突之髓鞘，也被破壞，故其發生作用於神經組織之軸突及非神經之髓鞘。 2.1.3.2 近端的軸突部份變化和遠端軸突發生的情況相似；但僅蔓延到軸突斷傷處的最近一個蘭氏結處。 2.1.3.3 神經元細胞體細胞體的變化，叫逆行性退化(retrograde degeneration)。變化在損傷後兩天，在細胞體內發生，兩週內破壞程度到達最大，Nissl 物質變細呈顆粒狀，分散至整個細胞質，叫做色素溶解(chromatolysis)。色素溶解於軸突阜開始，而後遍於整個細胞體。此外，細胞核會從中央位置移至細胞的周圍，細胞體腫大且圓。如果受傷處愈接近細胞體，色素溶解和細胞漲大的程度嚴重。在一些神經元中，靠近細胞體軸突的損傷可能導致. 8.

(17) 神經元的死亡。另一方面，受傷離細胞體越遠之軸突時，可能對神經元細胞體沒有造成傷害。. 2.1.4 周邊神經再生周邊神經再生涉及兩大因素：環境因子與神經元本身。神經軸突斷傷後，這兩種因素的相互作用決定了神經再生結果。環境因子目前研究的重點在於 Schwann 細胞、細胞外基質與神經營養因子[26]三部分。而周邊神經本身則關注軸突萌芽(axonal sprouts)的產生、再生軸突生長(regenerating axon outgrowth)、再支配原本標的三個主要步驟。周邊神經的重建過程如下：首先 Schwann 細胞進行有絲分裂，並填滿近端處神經內管中的空間。此細胞分裂可能發生至下一個蘭氏結，也可能遠及遠端的作用器官。當小的神經缺口存在於斷端時，分裂中的 Schwann 細胞形成一些索帶狀於此缺口之間。接著每個近端軸突終點會產生很多細胞芽或有球狀頂部的纖絲。這些纖絲沿著 Schwann 細胞間的裂縫前進，穿過近端和遠端神經處的間隔，向遠端生長並和 Schwann 細胞接觸。明顯地，來自很多不同軸突的纖維可能進入一個內神經管中。然而，只有一個纖絲會繼續存在，其他的將退化。當此一纖維進入遠端神經後，將重新活化感覺或運動作用器官。一旦軸突到達末端器官時，. 9.

(18) 相鄰的 Schwann 細胞開始覆蓋此軸突並形成髓鞘。此過程在原來病變的地方開始，並向遠端擴展。藉此，蘭氏結逐漸形成。軸突到達適當的作用器官需要幾個月，視神經傷害的位置而定。軸突生長的速率約每天 2~4 mm。然而必須考慮當軸突穿過受傷的位置時，再生速度會有些延遲，約每天 1.5 mm。又再生的軸突纖維直徑至多能到達原有直徑的 80％。因此，再生軸突的傳導速率氏無法達到和原來軸突一樣的程度。. 2.1.5 周邊神經斷傷的修補技術現有的周邊神經斷傷修補技術，有下列五種方式。選用何種接合方式，神經斷裂的間距是重要的決定因素。 2.1.5.1 斷端縫合術(suture technique) 斷端縫合術是將神經受損的兩斷端拉近對齊並給予縫線縫合。在進行神經接合時，除了神經受損的兩斷端需對齊外，還需注意縫合後的神經接合面不能有太大的張力以避免神經再生受影響[27, 28]。 2.1.5.2 組織黏著劑黏合法(Tissue adhesives) 組織黏著劑黏合法是將神經雙斷端修剪整齊並接合，然後將神經兩斷端距離斷面遠處神經外膜上行暫時性縫合神經，接著將神經接合面的. 10.

(19) 外部包著纖維蛋白膠以修復神經。此法是希望減少縫線所可能造成的異物反應[29, 30]。 2.1.5.3 雷射神經縫合法(Laser neurorrhaphy) 此法是以雷射來接合受損神經處，希望防止縫線之異物所造成的異物反應。學者指出因雷射所產生的能量會對受損的神經纖維造成熱傷害且進行神經修復其結果不優於斷端縫合修復法，所以仍以斷端縫合修復法為優先選擇[31, 32]。 2.1.5.4 神經移植手術 1932 年，Balance 首先採用自體神經移植的方法來修復神經損傷，獲得比較理想的效果，修復斷損神經的間距有所增加，目前這一方法已經成為臨床修復神經缺損的一種經典方式。其他的自體組織如靜脈、動脈、反轉靜脈，肌肉，血管等橋接損傷神經的方法也得到發展[28]。手術時，先將兩斷端的神經瘤及斷端間的疤痕組織移除，藉助顯微技術，將兩斷端附近之神經外膜移除，之後將兩斷端之神經束群分離，最後將移植入的神經兩端之神經束群與原斷端之神經束相縫合神經移植手術適用於較長的神經間隙缺損。它的優點是神經移植成功率高，缺點是移植神經來源的取得相當困難，同時在取得神經移植段時可能導致其他部位功能的缺損。 11.

(20) 2.1.5.5 神經導管接合術周邊神經導管接合術就是用生物或非生物的材料製成導管，再將神經的遠近斷端放入管內，兩斷端神經外膜與管壁固定[33]隨後神經軸突即可沿著管腔從近端長入遠端。此法適用於較長的神經間隙缺損。此法優點：1. 神經導管使再生軸突的微環境從周圍環境中完全獨立出來。神經再生沒有穿透性，一遇障礙生長就會中止，神經導管提供保證神經再生的通道，防止周圍結締組織侵入，避免神經瘤的形成[34]；2. 神經導管可提供和維持軸突生長所需的環境，保持內源性和外源性的神經營養因子、生長因子等促進軸突生長的刺激物質。並且因神經導管中生物環境可以人為控制和改變，為研究神經營養因子的促神經再生作用提供了一個可靠的工具[35, 36]；3. 應用神經導管可避免自體神經移植的一些併發症，如導致供區創傷性神經瘤的形成。神經導管接合術為本研究之主題，故於 2.2 節專章討論。. 12.

(21) 2.2 神經導管接合術 2.2.1 與神經導管接合術相關的研究主題近十幾年來，學者們致力於探討與神經導管接合術相關的研究主題，包括：1. 神經導管的材質；2. 神經導管的樣式與塑型；3. 利用神經導管建構利於周邊神經再生的生物微環境；4. 神經導管的內徑、壁厚 [37, 38]. 、表面性質. [35, 39]. (光滑或粗糙)等物理性質；5. 降解性神經導管製. 材之交聯方法；6. 探討施行神經導管接合術後，再投與口服藥物[40,. 41]. 或針刺、電針[42]、雷射[43]刺激對於周邊神經再生的影響。各式各樣的研究，其目的均在於希望能縮短再生的時間、擴大再生的間距、提升再生神經的成熟度、促進神經功能的恢復、減少神經導管之併發症。. 2.2.2 矽膠管內神經再生之細胞學變化神經導管內神經再生的基礎理論迄今未臻完善，透過神經導管接合術的廣泛被研究與觀察，有助於對周邊神經再生的認識。以矽膠管進行神經導管接合術，修復大鼠截斷的坐骨神經，在矽膠管內神經再生的典型細胞學變化如下：. 13.

(22) 2.2.2.1 液體堆積(fluid accumulation) 接合後一天內，矽膠管內立刻充滿了淡黃棕色液體，此液體內含有血清及其他細胞體液[26]。研究顯示，此液體含有數種成份，例如 laminin、 fibronectin 及神經營養因子，而這些物質能對體外培養的神經元產生促進生長的作用[44]。Williams[45]等(1983)為期四週的實驗顯示，管內液體在整個實驗期中均能圍繞著再生神經組織。 2.2.2.2 纖維橋的形成(fibrin bridge) 術後一週內，易碎的纖維橋(含 fibroblast、fibronectin、leukocyte、 erythrocyte)逐漸在管內形成，它沿著管的中軸移動，之後將兩斷端接合起來[46]。Williams 等(1987)也指出，接合後一週，再生神經是由 fibrin matrices 所組成，其中包含了 mast cell 和紅血球等[35]。這纖維橋提供了陸續遷入的 fibroblast、Schwann 細胞及軸突一個良好的骨幹。接合後十四天，經染色後的纖維橋，可見非常細絲狀的 laminin 和 fibronectin。纖維橋的中段通常是狹窄的，纖維橋在神經再生的初期(一週內)比其他時間而言有較大的截面積[47]。 2.2.2.3 纖維母細胞移行(fibroblast migration) 接合後第七天，纖維母細胞增生且開始從兩斷端進入纖維橋，這些纖維母細胞外觀上呈現長條形，缺少基底膜，內部是明顯擴張的粗內質 14.

(23) 網[47, 48]。一但纖維母細胞進入纖維橋，這些細胞會在矽膠管內形成一向心形狀的細胞層，包圍著兩斷端。之後，這些細胞會由斷端進入纖維橋的核心區[47]。十四天後，數層向心狀排列的纖維母細胞已圍繞著纖維橋的核心區[46]。 2.2.2.4 Schwann 細胞移行(Schwann cell migration) 當以 Toluidine blue 染色時，Schwann 細胞可以看到具有中密度的細胞質和一個卵圓形、白色的細胞核[49]。Schwann 細胞的增生和遷徙在神經接合後的一週是較明顯的，這個現象則與再生神經中 Schwann 細胞的 mitogenic factor 有關[46]。Schwann 細胞自兩段端進入纖維橋[47]，它的基底膜提供了再生軸突吸附及生長的基質[46, 47]。. 2.2.2.5 血管芽形成(vascular sprout) 血管細胞在神經軸突生長的環境上，扮演舉足輕重的角色。血管芽在接合後的兩週，自斷處長出，血管的移行經常在 Schwann 細胞和 fibroblast 之後。血管可以在再生細胞的邊緣和中央處被發現 [48] 。 Williams[45]等觀察到，接合後四週，整條再生神經(10 mm)均可看到血管的存在。Jenq 與 Coggeshall[48]發現，接合後八週，在矽膠管內再生細胞血管數與血管大小(平均血管數 48 個，最大直徑 70 μm)比較，有增加的. 15.

(24) 趨勢。Danielsen[49]等則發現生長促進物質，例如 rat amnion membrane matrix(rAMM)會促進矽膠管內再生神經近端的血管數增加(和接合後十六日的對照組比較)。 2.2.2.6 再生單元和 Schwann 細胞柱 Williams[45]等以矽膠管修補被截斷之大鼠坐骨神經(10 mm gap)，發現接合後兩週，距近斷端 1-5 mm 處，Schwann 細胞聚集在一起，圍繞在再生之無髓鞘軸突的周圍。這些軸突和 Schwann 細胞的聚集體也可以在類似的神經導管接合術中出現，這些聚合體被稱作“再生單元”[50]。 Williams 等也發現神經導管接合術中許多細胞聚集在遠斷端 1-3 mm 處的矽膠管內，這些來自遠斷端的聚合物稱為“Schwann 細胞柱”。當組織以 Toluidine blue 染色時，可見蒼白的 Schwann 細胞核[47]。這些 Schwann 細胞柱通常有數個細胞厚，它們的特徵是擁有基底膜，以及在細胞質內有許多的細長絲狀纖維。當來自近端的再生軸突和遠端的 Schwann 細胞柱接觸後，Schwann 細胞柱會影響再生軸突往遠斷端生長，Williams[45]等在 1983 年曾發現，再生過程的第四週時，位於再生神經遠斷端附近的 Schwann 細胞柱會被再生單元所取代，意味著來自近端的軸突成功地進入神經的遠斷端。. 16.

(25) 2.2.2.7 髓鞘化(myelination) 周邊神經的髓鞘是由 Schwann 細胞所形成。最早期的髓鞘化約在接合後三週發生，此時在再生神經的近端可見軸突(約 0.1 μm 厚)和薄且緊密的髓鞘[46]。Le Beau[26]等在 1988 年的實驗發現，隨著接合後時間的增長，髓鞘的厚度變得愈厚(術後 42 天，髓鞘厚度 0.37 μm，術後 435 天，髓鞘厚度 0.57 μm)。然而，經由再生過程產生的髓鞘，和正常神經的髓鞘比較起來，通常是較薄的。儘管如此，電生理的研究顯示，經矽膠管再生的神經之持續興奮期和不反應期，和正常的神經比較起來是一樣的 [46, 51]. 。. 17.

(26) 2.2.3 神經導管之研發現況回顧 2.2.3.1 神經導管的分類神經導管的分類，依據製成材料的不同可分為生物材質為主之材料 (biological materials)，及人工合成材料(synthetic materials)二大類。生物材質為主之材料又可分為生物結締組織材料，主要包括靜脈、骨骼肌、羊膜等；與來自生物體的天然材料，主要包括膠原蛋白(collagen)、明膠 (gelatin)、幾丁質(Chitin)與幾丁聚醣(Chiosan)等。人工合成材料又可分為非生物可降解性合成材料，主要有矽膠管(silicone)、金屬等；生物可降解性人工合成聚合物，主要包括聚乳酸(polylactin acid, PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid, PGA)、聚磷腈(polyphosphazenes)等。依據神經導管對周圍環境物質的通透性可分為通透性材料和非通透性材料。另外，神經導管的管腔中可加入一些物質，以營造一個更有利於神經再生的微環境。添加物可分為三大類：Schwann 細胞及神經片段；不溶性細胞外基質分子：包括層粘連蛋白(laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)和膠原蛋白等；可溶性神經營養趨化因子。. 18.

(27) 2.2.4 降解性生醫材料交聯劑的選擇當生醫材料植入體內後，免疫系統及酵素的攻擊往往會使材料被分解而無法發揮其功能。為了使材料在植入體內之後，具有抵抗免疫系統及酵素的攻擊能力，以及增加材料在體內的壽命，所以生物膠和生物材料在植入之前，皆必須先經過交聯劑的交聯處理。被用來交聯生醫材料的交聯劑有 formaldehyde、glutaraldehyde、 epoxy compound、carbodiimide 以及 genipin 等。在這些生醫材料交聯劑中又以 glutaraldehyde 在應用最多，但以 glutaraldehyde 交聯處理的生醫材料在過去經驗，遭遇組織硬化、鈣化及纖維化等問題[52-55]。水溶性的 carbodiimide 是另一種常被使用的交聯劑，其中又以 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-cabodiimide (EDC)被使用的最多。因為其作用機制是先活化生物組織上的基，再與生物組織上另一自由胺基形成胜肽鍵結，交聯作用完成後，carbodiimide 本身並不會存在生物組織之間，故又被稱為“zero-length”的交聯劑。其特別的作用機制能有效的減低組織鈣化的問題。另外，綠梔子素(genipin)是一種天然的交聯劑，由Sung等在1998及 1999年從中藥梔子果實中萃取出來，用來交聯處理生醫材料[56]，具有低毒性、高交聯度、高生物相容性之優勢。. 19.

(28) 2.2.5 理想降解性神經導管之要件理想的降解性神經導管至少須具備以下條件[57]：1. 材料具有良好的塑形性。2. 神經導管具有良好之手術縫合特性，操作簡便。3. 可滅菌。 4. 材質的機械強度足以提供神經再生之保護空間，在神經再生過程中能維持形狀不塌陷。5. 管的內徑要比神經外徑略大，以便套接且避免管壁降解性膨脹壓迫神經。6. 完全裂解所需時間較長，可以充分保護再生狀態下之神經軸突延伸至受傷遠端。再生完成後能自行降解。7. 材質的生物相容性佳，不會與周圍組織產生過度免疫反應。8. 管壁利於吸附和釋放神經營養因子，並可提供神經軸突生長錐爬行之介面，穩定神經纖維結構。. 2.3 組織與生醫材料之交互作用[58] 生物體對於外來物質通常會有排拒、除去的傾向。如果外來物質很小，吞噬細胞會進行吞噬消化的作用將之消滅，若無法消滅，則吞噬細胞會一直將該物質圍住，不使其擴散。植入材料對生物組織所造成的影響程度，分成四類：材料在體內完全不起物理及化學反應者，即完全生物惰性材料 (totally bioinert materails)。由於不會產生任何毒性，及不利組織之因素，又不會被生物體消化吸收，因而僅由一薄層的膠原纖維包膜(結締組織)，把材料與組織隔離，而血管因無法穿透植入材料，因此材料週圍會有許多血管分佈。材料在體內會產生蛻化或與體液反應者，如果反應或蛻化速度緩慢，蛻化殘留物與反應物，很快可被生物體吸收消化者，則纖維包膜會增厚，而纖維包膜靠近植入材料的界面，會有大量活躍的吞噬細胞及纖 20.

(29) 維母細胞。材料在體內會產生磨蝕或腐蝕作用者(abrasion or corrosion)，長期刺激植入材料週圍組織，材料週圍除了出現很厚的纖維包膜結締組織及活躍吞噬細胞外，也會引發鄰近組織的發炎現象，甚至產生肉芽腫。若材料在體內會產生腐蝕或蛻化作用，但腐蝕及蛻化產物，不但不會傷害組織，反而是組織的重要組成份之一，則植入材料與組織間，不僅沒有纖維包膜形成，甚至完美的結合在一起。. 2.4 明膠 2.4.1 來源與萃取明膠(gelatin)主要由動物結締組織中的膠原蛋白(collagen)所提煉出來，如牛皮、豬皮、軟骨或肌腱等，因此屬於膠原質類的蛋白質(protein)。明膠提煉的方法，主要有三個步驟：第一由原始材料中去除非膠原的成分。第二將純化的膠原轉化成明膠。第三去除水分。一般的處理方法可分為酸處理法及鹼處理法，至於醫藥級的明膠通常是由酸處理法提煉的。膠原蛋白的螺旋結構會引發生體排斥性而降低其生物相容性。學者們發現，明膠衍生自膠原蛋白，為膠原蛋白之二級結構破壞後的產物，其抗原性較膠原蛋白低，所以在應用上可降低排斥性，又因純化且符合醫藥級要求的明膠，其價格比膠原便宜許多，所以本研究選用明膠做為神經導管製材。 21.

(30) 2.4.2 特性明膠是屬於可逆熱塑性(thermo-reversible)的高分子材料。加入水時，明膠粉末膨脹形成溶液，冷卻時成一凝膠體，為物理性凝膠。加熱可使凝膠再度還原變為溶液。乾燥的明膠在密封的容器內可以保存許多年。當加熱到 100℃時結構便會分解成為含碳的塊狀物，同時放出氨與啶。在 35~40℃以下明膠會吸收 5~10 倍的水分膨脹形成凝膠。. 2.4.3 組成成分明膠由大約 1000 個胺基酸(amino acids)所組合而成的，構成明膠的主要胺基酸有甘胺酸 (glycine) 、脯胺酸 (proline) 、羧基脯胺酸 (hydroxyproline)[59]。. 2.4.4 化學結構明膠是立體高次結構遭受破壞而變性的膠原蛋白[60]，結構上，明膠分子為含有氨基乙酸-X-Y 的三元重複序列。X 和 Y 經常是 proline 和 hydroxyproline 的胺基酸物質。這些序列負責螺旋結構的部分，進而形成長鏈。也因為這些結構，在膠化過程中水會被固定在明膠蛋白質鏈間形成凝膠體。明膠單體結構如圖 2-3[59]，結構鏈的排列方式如圖 2-4[58] 而非極性基團再以螺旋結構的方式，組成三條互相纏繞的分子明膠鏈，如圖 2-5 所示[58]。. 22.

(31) 圖 2.1 明膠單體結構[59]. 圖 2.2 明膠結構鏈[58]. 圖 2.3 明膠分子鏈結構[59]. 23.

(32) 純明膠是由大量的-CO-NH-CHR-以立體交叉的形式所構成，由於其中存在著氨基和羧基等極性基團，而水分子屬於極性低分子，所以會佔據多肽鏈間 N 或 O 原子的地方，並與極性基團產生親和，所以隨著水分子不斷的遷入，明膠的結構間隙也會不斷擴大，因此明膠會具有明顯的吸水特性[61]。. 2.4.5 Bloom number 由於明膠係膠原蛋白經熱破壞某些鍵結而來，原料及萃取過程之不同會造成所得明膠之分子量不同，明膠分子量越大時，所形成之膠體強度越高。用一已知濃度的明膠做成 4 mm 厚的樣品以一定的力量擠壓， Bloom number 越高的明膠，毀壞所需要的力量也越大，這表示其結構的機械強度越強。通常 Bloom number 跟分子量成正比關係(表 2.1)。Bloom number 的單位為公克(g)[62]。表 2.2 Bloom Number 與 Molecular Weight[61] Bloom Number. Average Molecular Weight. 50-125(Low Bloom) 175-225(Medium Bloom) 225-325(Hight Bloom). 20，000 - 25，000 40，000 - 50，000 50，000 -100，000. 24.

(33) 2.4.6 明膠的應用 2.4.6.1 明膠於醫藥上之應用明膠於醫藥上可以用來製造膠囊[63]、錠劑[62]、止血棉[62]、外科手套粉末[62]以及血漿替代物(plasma substitute)等；另外，陳等證實可自明膠水解液中製備血管收縮素轉化酶抑制劑 (angiotensin-converting enzyme inhibitor peptide, ACEI 胜肽)以供發展長效性之預防高血壓機能性飲料[64]；還可以在經去纖維化(defibrinated)的血液中添加明膠作為沈降劑(sedimentation agent)，幫助自上清液中回收淋巴球[62]，做為醫學研究用途。 2.4.6.2 明膠於食品上之應用明膠可應用於各類點心與食品中作為增稠劑、凝固劑、安定劑、結著劑、營養劑及發泡劑，其產品如：糖果、巧克力、米果、餅乾、蛋糕、冰淇淋、牛奶糖、牛軋糖、布丁、果凍、洋火腿冷凍水餃、小籠包、湯包以及需要保持懸浮狀態不使沈澱之飲料[62]。 2.4.6.3 明膠於工業上之應用明膠於工業作為懸浮及黏著用，其產品如：紙膠帶、砂布、金屬粉黏著用、玻璃工業爆花用、高級樂器、人造水果、印刷版用、銅器雕花腐蝕及信鴿飼料[62]。. 25.

(34) 2.5 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) 2.5.1 化學結構 EDC 之化學結構如圖 2.4 所示。. 圖 2.4 EDC 之化學結構式[65]. 2.5.2 EDC 交聯生物組織之機轉 EDC 會先活化生物組織內 glutamic acid 或 aspartic acid 殘基上的 carboxyl groups 形成 O-acylisourea，而 lysine 或 hydroxylysine 殘基上的 amino groups 會對 O-acylisourea 做親核攻擊，形成一 peptide bond，同時也會產生 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)urea 的衍生物[66]。其反應化學式如圖 2.5 所示。. 26.

(35) 圖 2.5 EDC 交聯生物組織機制圖[14] 由於 O-acylisourea 在水溶液中並不穩定，可能會水解成原始的 carboxyl groups，因而降低生物組織交聯程度，所以在進行交聯反應時會再添加 N-hydroxysuccinimide(NHS)，NHS 可以使 O-acylisourea 轉化成一較穩定，不易水解的 NHS-activated carboxylic acid group，之後 lysine 或 hydroxylysine 殘基上的 amino groups 再對 NHS-activated carboxylic acid group 做親核攻擊，形成 peptide bond，如此便可增加生物組織之交聯程度[66]。 27.

(36) 2.5.4 以 EDC 為交聯劑的相關研究 EDC 很廣泛的被應用於各個研究領域。例如能用於合成 peptide；也可用於定量蛋白質的 carboxyl groups[67]。因為其為“zero-length”的交聯劑，交聯作用完成後，EDC 本身並不會存在生物組織之間，故毒性極低，能有效的減低組織鈣化的問題，所以也被用於製造各種生醫材料。Liu 等於 2006 年利用 EDC 交聯膠原蛋白，製作眼角膜材料[68]；Chang 等於 2007 年首先將 EDC 交聯明膠做為神經導管的材料，用於修復週邊神經損傷[12]。. 2.6 梔子與綠梔子素 2.6.1 梔子 2.6.1.1 來源梔子，始載於《本經》，為茜草科常綠灌木植物山梔 Gardenia jasminoides Ellis. 的乾燥成熟果實，主要產於長江以南各省。 2.6.1.2 採製秋季果實成熟呈紅黃色時分批採摘，除去果柄及雜質，蒸至上汽或置沸水中略燙，曬乾或烘乾。入藥生用、炒用、炒焦或炒炭用。 28.

(37) 2.6.1.3 歷代本草記載功效《神農本草經》：梔子，味苦寒，主五內邪氣，胃中熱氣，面赤酒庖齇鼻，白癩赤癩瘡瘍[69]。《唐‧新修本草》：梔子，味苦寒，無毒。主五內邪氣，胃中熱氣，面赤酒皰渣鼻，白癩赤癩，瘡瘍。療目熱赤痛，胸中心大小腸大熱，心中煩悶，胃中熱氣[70]。《本草綱目》：梔子，苦寒、無毒。主治五內邪氣，胃中熱氣，面赤，酒皰渣鼻，白癩赤癩瘡瘍。療目赤熱痛，胸心大小腸大熱，疕中煩悶。去熱毒風，除時疾熱，解五種黃病，利五淋，通小便，解消渴，明目，主中惡，殺蟅蟲毒。解玉支毒。主瘖啞紫癜風，治心煩懊襛不得眼，臍下血滯，而小便不利。瀉三焦火，清胃脘血，治熱厥心痛，解熱鬱，行結氣，治吐血、衄血、血痢、下血、血淋、損傷瘀血，及傷寒勞復，熱厥頭痛，疝氣湯火傷[71]。《本草備要》：梔子，苦寒，輕飄象肺，色赤入心，瀉心肺邪熱，使之屈曲下行，從小便出，而三焦之鬱火之解，熱厥心痛以平，吐衄血淋血痢之病以息，治心煩懊襛不眼，五黃五淋亡血，津枯口渴，目赤，紫癜白癩，頗渣瘡傷。生用瀉火，炒黑止血、薑汁炒止煩嘔，內熱用仁，表熱用皮[72]。《中國藥物學》：梔子效用：為消炎解熱藥，用於急性膽道炎，黃 29.

(38) 疸，胃及食道炎，煩懊欲吐，上部充血性炎症，目赤耳鳴聲嘎均有效，且有止血之攻；內服止吐血、衄血、急性尿道炎，血尿淋痛；外用消炎消腫，對於打撲挫傷腫痛，用生梔子消粉雞蛋清調敷患部有卓效[73]。主治：五內邪氣時熱，心煩懊襛，瀉三焦火，清胃脘血，治五種黃病，通小便，解消渴。 2.6.1.4 成份果實中含黃酮類梔子黃色素 (gardenin) ，其經水解成為甙元 (gardenidin)；藏紅花素(crocin)；藏紅花酸(crocetin)；梔子甙(gardnoside)；去氫梔子甙(geniposide)；綠梔子素(genipin)；格尼泊素-1-β-D-龍膽二糖甙(genipin-1-β-D-gentiobioside)；梔子酮甙(gardoside)；雞屎藤次甙甲酯 (scandosidemethylester)；熊果酸(ursolic acid)；gareden；β-sitosterol；甘露醇(mannitol)；韖質(tannin)；果膠(pectin)；山梔甙(shanzhizide)；種子含脂肪油 14~18%[73]。 2.6.1.5 藥理作用對消化系統的影響對肝臟功能的影響：梔子果實提取物能增加大鼠肝臟二磷酸尿甙－葡萄糖脫氫酶的活性；梔子還能減輕四氧化碳引起的肝損害。利膽作用：梔子能增加膽汁分泌，並能降低血中之膽紅素，可去黃. 30.

(39) 疸，此作用與中醫之清利肝膽溼熱相似。對胃液分泌及胃腸運動之影響：綠梔子素能使幽門結紮的大鼠胃液分泌量滅少；綠梔子素能抑制 carbacol 造成之胃酸亢進；去氫梔子甙 (genioside)對大腸之蠕動有促進作用。對中樞神經系統的作用：梔子醇提取物能延長睡眠時間，對於熱性病引起的腦充血和神經興奮而成之心煩、失眠、憂鬱有療效；梔子水提取物有鎮痛作用。降血壓作用：梔子煎劑和醇提取液，不論口服、腹腔或靜脈注射，均有持久性的降血壓作用。抗菌作用：梔子的水浸劑對多種皮膚真菌，均有不同程度的抑制作用；對金黃色葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、溶血性鏈球菌、卡他球菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌等有抑制作用。其他梔子提取物製成油膏，可加速軟組織的癒合。大量投與小鼠去氫梔子甙，其尿液呈青色。有抑制發熱中樞作用，作用與黃芩、黃連相似。. 31.

(40) 2.6.1.6 臨床應用梔子以清熱瀉火為主要功效，所以臨床應用上也以此為主。清熱除煩、解毒梔子可清心肺之熱，熱清則心煩、不眠、狂躁必除；其亦可瀉上、中、下三焦火熱。用於熱病引起的發熱、心煩鬱悶、不眠、口苦、口乾，甚或神昏譫語、苔黃，常與淡豆鼓同用，方如傷寒論梔子豉湯。又梔子配丹皮、黃芩、金銀花，治五心煩熱、煩燥；治生氣而致心情抑鬱，可用含梔子的化肝煎。用於治療流行性結膜炎、目赤腫痛、多淚，梔子能消炎消腫。因梔子可抑制痢疾桿菌，故於痢疾初期，可配合它藥合用。清利溼熱、消黃疸梔子有利膽、消黃作用，可引起膽囊收縮，增進膽汁分泌。肝膽病常用之，可治療肝膽溼熱鬱結所致的發黃，如急性黃疸型肝炎、傳染性肝炎可用梔子去黃疸，配菌陳蒿、大黃，於傷寒論中有述及本方：治傷寒七、八日，身黃如橘子色，小便不利、腹微滿者。又梔子配黃柏、甘草，組成梔子柏皮湯，本方治傷寒身黃發熱。熱證肝病，可用含梔子之龍膽瀉肝湯。膀胱溼熱留聚，如尿道炎、小便不利尿道刺痛、尿黃赤，脈滑數，梔子常配木通、車前子、滑石、黃柏、扁蓄、澤瀉、豬苓等，如八正散。. 32.

(41) 涼血、止血、活血以山梔炭配青黛、瓜蔞仁、海浮石、訶子，方如《丹溪心法》中的咳血方，可用於治療肺熱咳血。梔子也常配生地、側柏葉、白茅根、丹皮、白芨、生藕節等止血藥，用於血熱所致之吐血、衄血、咳血、眼內出血、尿血。如用於治療便血，常配地榆。梔子有袪瘀消腫作用，能治挫傷、扭傷、跌傷，以生梔子研末，用雞蛋白、麵粉調勻，濕敷腫處。用於痔瘡熱痛，可用黑山梔研末，以凡士林調勻塗抹。 2.6.1.7 臨床使用應注意事項脾虛便溏、無溼熱者忌用，孕婦慎用。一般用量一至三錢[74]。. 33.

(42) 2.6.2 綠梔子素(genipin) 2.6.2.1 綠梔子素之萃取與純化首先將梔子果實壓碎，置入 Soxhlet 萃取器，以氯仿洗滌 2 次以去除梔子果實中的油脂成份，接著倒入適量的醋酸乙酯，再將 Soxhlet 萃取器置於加熱板上加熱循環萃取 6 小時，之後在室溫下將萃取液自然冷卻，即可得去氫梔子甙的結晶粉末。萃取出來的去氫梔子甙結晶粉末經過濾及烘乾後，以 pH 4.5 的醋酸緩衝溶液溶解，然後在 35℃下以上述固定化的 β-glucosidase 酵素將去氫梔子甙進行脫 glucose 進而轉換成綠梔子素。最後再以適當的有機溶劑來萃取水相中的綠梔子素，再將此萃取液做濃縮處理，即可得到高純度的綠梔子素結晶粉末[56]。 2.6.2.2 綠梔子素之化學結構綠梔子素的化學結構如圖 2.6. 圖 2.6 Genipin 的化學結構[65] 34.

(43) 2.6.2.3 以綠梔子素為交聯劑的相關研究綠梔子素交聯生物組織之生物相容性綠梔子素交聯生物組織之生物相容性主要可從下列三方面評估：發炎程度、變性溫度、交聯組織機械強度的測試。交聯後之生物組織在植入生物體內時會引起許多細胞的攻擊，如 macrophages、polymorphonuclear leukocyte 及 fibroblasts。這些發炎反應程度越低即表示殘存於生物組織中未交聯的交聯劑生物毒性越低。變性溫度是生物組織在加熱過程中，其內膠原蛋白的結構突然發生改變(denature)時的溫度。一般來說，變性溫度可以用來做為生物組織被交聯的程度，假若生物組織的變性溫度愈高，則代表生物組織被交聯的程度愈高[56]。交聯組織機械強度的測試，是將測試組織裁成狗骨頭狀試片，再利用 Instron 材料測試機伸速率，來測量組織試片的最大抗拉力 (ultimateload)[56]。 Huang[75]等比較綠梔子素、戊二醛(glutaraldehyde)和 epoxy 三種交聯劑的生物相容性。結果顯示綠梔子素交聯的生物組織引發之發炎反應最少，變性溫度與機械強度也都較另兩組高，證實了綠梔子素是一種相對而言生物相容性較佳的交聯劑。. 35.

(44) 綠梔子素交聯生物組織之反應最適化條件綠梔子素在不同溫度及 pH 值的水溶液裡均有降解的現象，其中又以高溫及鹼性的環境對綠梔子素的降解影響較為嚴重，因此綠梔子素交聯生物組織較適合在室溫與中性的條件下進行[56]。綠梔子素交聯生物組織之可能機轉綠梔子素與含有胺基的化合物可能的反應機制有下列數種推論：1. 綠梔子素本身的環狀半縮醛(cyclic hemi-acetal)結構在水中可能開環形成雙醛基(dialdehyde functional group)；2.梁崇正[62]藉由定量的計算以及光度計實驗推論明膠中的 arginine 就是與綠梔子素產生交聯反應的主要反應基。綠梔子素交聯生物組織和神經再生之相關研究 Liu[76] 等以綠梔子素交聯明膠作為細胞外間質 (extracellular matrix)，填充於矽膠管內，縫合在坐骨神經兩斷端間，和單純矽膠管組相比，神經再生成功率明顯較高。Chang[77]等以梔子素交聯明膠作為神經生長激素(NGF)的載體填充於 polycaprolactone 神經導管中，縫合在坐骨神經兩斷端間，證實梔子素交聯明膠載體可長時間釋放有效濃度之 NGF，對神經再生有幫助。Chen[11]等以梔子素交聯明膠作為神經導管材料，植於 10 mm 間隙之坐骨神經斷端間，再生成功率 100%，但再生神經有生長遲滯現象。 36.

(45) 2.6.2.4 綠梔子素對的神經細胞的影響 Yamazaki 等在實驗中發現綠梔子素跟神經生長因子一樣，皆能經由 MAPK pathway 引發 PC12 細胞株神經突突出，且神經突突出的長度隨著綠梔子素濃度上升而有增加的趨勢[16,. 78]. 。另外，綠梔子素在 20-40μ. M 之劑量下，可抑制 Amyloid β protein 對 hippocampal 神經元細胞株的神經毒性[79]。 2.6.2.5 綠梔子素的其他相關研究梔子中抗發炎的成分主要是綠梔子素[80]，綠梔子素有抑制 NO 生成、清除自由基之作用[81]，此外，綠梔子素在口服或是腹腔注射皆可抑制肝細胞凋亡(apotosis)[82]，並可抑制肝臟星狀細胞(hepatic stellate cell) 的作用而治療由 CCl4 引發之肝纖維化[83]。再者，綠梔子素可抑制 TGFβ及 CTGF mRNA 表現而改善α-TN4 lens 上皮細胞的纖維化反應[84]。在基因毒性方面的測試證明，當綠梔子素濃度低於 50 ppm 不會造成 clastogenic response，細胞毒性測試中，綠梔子素並不影響細胞週期，所以綠梔子素具有低細胞毒性[85]。. 37.

(46) 2.7 周邊神經再生之相關蛋白質 2.7.1 Synapsin Ι Synapsin I 包括二個幾乎同性質同功能的蛋白質，synapsin Ia (MW： 86000)和 synapsin Ib (MW：80000)，是一個神經元特異性蛋白質，分佈在 CNS 及 PNS 的突觸，幾乎所有的突觸均有 synapsin I 的存在[86]。 Synapsin I 是和突觸小泡（synaptic vesicle）作用相關的磷酸化蛋白（phosphoprotein），是一個長條狀的蛋白質，有一個圓形的頭和富含 proline 的尾巴[86]，由神經細胞本體合成，經由軸突運送（axonal transport）至突觸末端，存在於神經末端的突觸前細胞膜（presynaptic membrane）； synapsin I 受相關神經傳導物質調控，經 c-AMP 或 Ca/Calmodulin 路徑被磷酸化，作用為引導突觸小泡至突觸前末端，與相關細胞骨架（cytoskeletons）結合，負責調控突觸小泡的聚集（cluster）、融合（fusion）與釋放神經傳導物質（neurotransmitter）[17, 87, 88]。除了調節神經傳導物質的釋放，相關文獻指出 synapsin I 會在發育及再生中的軸突尖端表現，推論和軸突的生成發育有關，包括軸突的延長（axonal elongation）與突觸的形成（synapse formation）[87, 89]。 Romano[90]等提及 PC12 細胞受 NGF 刺激引起的分化過程，成熟神經末端突觸小泡出現時，synapsin I 的表現約上升為 3 倍。相關實驗中，. 38.

(47) Das[17]等發現 PC12 細胞受 NGF 刺激引起的分化過程中，神經突起生長在第 6 天達到停滯期，而 synapsin I 表現量在第 5-7 天快速增加，作者說明 synapsin I 與成熟神經末端突觸的形成和突觸小泡的產生有關，進而推測 synapsin I 可用來當作神經末端成熟的指標。 Akagi[87]等在大鼠坐骨神經輾壓損傷（crush-injury）試驗中，說明 synapsin I 在神經再生萌芽處以及生長錐有大量表現，尤其在這些位置含有囊狀胞器（vesicular organelle）處表現較多，作者推論 synapsin I 扮演著運送小泡（vesicles）至再生神經萌芽處及生長錐基底膜（plasma membrane）位置的重要角色。. 2.7.2 GAP-43（growth associated protein 43） GAP-43（Growth associated protein-43）又稱作 B50、F1、PP46、 neuromodulin，是一個神經特異性的軸突膜蛋白，80 年代初由 Skene 等人首先從兔再生的外周神經中獲得[91]，它廣泛存在於神經組織中，尤其是在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高[92]，成熟未受損傷的神經組織亦有 GAP-43 表現，但表現量很低[93]。 GAP-43 蛋白質的 N 端結合於細胞膜，而 C 端則和細胞骨架 (cytoskeletal components)相連[94]，可透過調節細胞骨架的組織架構改變細胞型態[95, 96]。其作用機制包括其為 protein kinase C（PKC）的受質，也和 G protein 活化、攜鈣蛋白（calmodulin）的釋放有關，提示 GAP43 39.

(48) 在神經再生生長錐的訊息傳遞中扮演重要角色[92]。 GAP-43 主要分佈在生長錐（growth cone）、生長中延長的軸突（elongating axon）和軸突突觸前末端（presynaptic terminals）[97, 98]，許多研究指出 GAP-43 在神經分化、神經生長和軸突再生過程扮演重要角色， Jap Tjoen San[99] 等證實，在嗜鉻細胞瘤細胞株 PC12 （pheochromocytoma）受 NGF（nerve growth factor）的刺激進行分化時， GAP-43 的 mRNA 和蛋白質表現量均會升高，Das[17]等在相關實驗中提出 GAP-43 的表現量至第 6 天達至平穩期（plateau），第 7 天則 PC12 細胞分化大致完成，說明 GAP-43 的表現和軸突的生長（axonal outgrowth）有一致相關性。有研究發現，在 transgenic mice 體內，過度的表現 GAP-43 會導致突觸新生，且在神經受損後，能促進軸突萌發[97]。亦有文獻指出，在 GAP-43 基因突變的小鼠，雖然有初步發育正常神經系統，但缺乏軸突的先導（pathfinding），大部分在出生後就死亡[97]，顯示抑制 GAP-43 的表現，不利於軸突生長。Kaneda[100]等在 zebrafish 視神經斷傷實驗中，證實 GAP-43 對 zebrafish 視神經再生之早期及晚期皆有助益，作者推論 GAP-43 的作用和軸突生長及突觸形成均有相關。Van der Zee[101]等則在大鼠坐骨神經損傷實驗中，指出周邊神經損傷時 GAP-43 表現量會升高，推論 GAP-43 的表現量可反應出再生神經萌芽的數目（number of sprouts）。. 40.

(49) 2.7.3 TGF-β1(Transforming growth factor-β1) TGF-β(Transforming growth factor-β)是個具多重用途的細胞激素 (cytokine)，單就神經受損後再生的過程而論，TGF-β 就扮演著極微妙的角色。 TGF-β 在哺乳動物中存有三種同質體(isoforms)：TGF-β1、TGF-β2 及 TGF-β3[102]。其中，在中樞及周邊神經受損時，以 TGF-β1 為主要表現 [103]. 。文獻報告指出，周邊神經受損後，TGF-β1 表現量大幅增加[104-106]，. 直至再生神經纖維長至受損處的遠部斷端，TGF-β1 的表現量隨即下降[105, 。Ridley[107]等在大鼠 Schwann 細胞株中加入 TGF-β1，證實 TGF-β1. 106]. 具有活化 Schwann 細胞的功能，可以促使 Schwann 細胞增生，且 Schwann 細胞本身會分泌 TGF-β1，藉由自泌作用(autocrine)的方式促進自身的增生。Einheber[108]等亦以體外細胞實驗證實 TGF-β 會促使 Schwann 細胞型態改變成增生力強、低度髓鞘化的形態，作者認為這樣的變化能誘導神經軸突萌發(axon spourt)及避免再生神經在往遠端生長時過早髓鞘化。 Matsuoka[109]等將 TGF-β1 加入培養之 Schwann 細胞株，證實 Schwann 細胞受 TGF-β1 刺激後會產生 LIF(Leukemia inhibitory factor)，具支持神經元存活及再生之能力。再者， TGF-β1 有神經滋養功能 (neurotrophic activity)，能促進運動及感覺神經元的存活[110, 111]。此外，TGF-β1 也是單核球(monocyte)、巨噬細胞(macrophage)等免疫細胞的化學趨性物質. 41.

(50) (chemotactic factor)，在 Walerian 退化過程中，能驅使巨噬細胞聚集至遠部斷端；TGF-β1 濃度≧1μg/ml 時能促使單核球分泌 IL-1 等細胞激素，促使纖維母細胞(fibroblast)增生[112]，進而使 collagen[113, 114]、tenascin-C[115, 116]. 等細胞外基質(extracellular matrix)表現增加，調控神經纖維生長。然而，就因為 TGF-β1 有促細胞外基質產生的作用[117, 118]，在神經損. 傷修復的過程，可能會形成纖維疤痕組織(scar tissue)，纖維組織會阻礙再生軸突往遠端生長[119-121]，且在神經幹(nerve trunk)產生的纖維疤痕組織會壓迫再生神經，造成再生軸突直徑減少[122]。所以，有許多學者，朝著抑制疤痕組織(scar-suppressing)的方向，設法改善周邊神經的修復成效。 Nath[103]等在 SD 大鼠坐骨神經斷端注入 TGF-β1 及 TGF-β2 的抗體，成功的使神經外膜(epineurium)的纖維母細胞數量下降，也使整體的膠原纖維堆積減少。但 Atkins[122]等在 SD 大鼠坐骨神經斷端注入 TGF-β1 及 TGF-β2 的抗體後，雖亦有效的減低纖維疤痕組織產生，但檢測再生神經複合動作電位及觀察髓鞘化神經元數目的結果卻證實此一操作整體而言對神經再生並無幫助，作者推論此結果代表 TGF-β 對於神經再生仍有不可忽視的重要性。綜上所述，TGF-β1 在神經再生過程中擔任著複雜的調節功能，如何在神經軸突生長及組織過度纖維化之間取得平衡，將是治療上的重點課題。. 42.

(51) 2.8 神經損傷的中醫觀點 2.8.1 神經系統在中醫學中的定位中醫雖沒有神經這個專有名詞，但以中醫學的角度及古典之記載，配合現代醫學之描述，仍有說明神經的概念。中樞神經系統方面，《黃帝內經》已有腦與髓的名稱，二者屬奇恆之府，與兩者相關聯的經絡有督脈、腎經、肝經、膀胱經等。但是周邊神經中醫典籍無正式神經名詞之文獻被提及，古人既然記載“度量切循，解剖視之”之解剖學之應用，理論上應將如同血管的周邊神經不致被忽略。既然如此，那周邊神經，應以何種論述來呈現？推論而言，應與經絡學說的可能性最高。周邊神經，其內有自律神經並行，分佈於頭面四肢軀幹與內臟各個器官，分佈的方式與心血管系統、淋巴系統相似。經脈在《黃帝內經》之《素問．本藏》：經脈者，所以行血氣而榮陰陽，濡筋骨，利關節者也；《靈樞．經脈》：雷公曰：願卒聞經脈之始生。黃帝曰：經脈者，所以能決死生，處百病，調虛實，不可不通；《靈樞．海論》：夫十二經脈者，內屬於府藏，外絡於肢節[123, 124]。體內器官，有五臟、六臟、奇恆之腑，皆與經絡有連繫。體外之頭面四肢與軀幹等部分，其主要的組織有皮、脈、肉、筋、骨等，也與經脈連接著，在《黃帝內經》中《經脈》、. 43.

(52) 《皮部》、《經筋》、《經水》、《脈度》，《骨度》各篇中有詳細的描述。莊氏：經脈，即屬今之周圍循環系統及周邊神經系統，前者包含：動脈、靜脈和淋巴管[125]。劉氏：經脈深在體內，出入於臟腑筋骨肌肉之間，遍佈於全身上下，頭面四肢[126]。所以周邊神經可視為經脈的一個部分，出入於臟腑筋骨肌肉之間，遍佈於全身上下，頭面四肢。但是，以十二經脈之循行，十二經脈之生理，無法百分之百與現在之周邊神經系統完全契合。. 2.8.2 周邊神經斷傷與相關之中醫病證由於中醫觀點上，沒有神經之論述，周邊神經受傷之範圍概括於外傷的病證中。在中醫未與西醫解剖學交流之前，傳統中醫不曾將周邊神經獨立看待。周邊神經損傷的病狀，會在許多病證中提及，但是內容是散在於不同篇章中，並沒獨立出來專論。中醫診治的整體觀中，診斷及治療設備之限制，加上古代傷科手術的水準，無法將外傷中的神經斷傷單獨處理。現代醫學將神經損傷分為神經失用、軸突斷傷、神經斷傷三大類。本實驗將範圍縮小至神經斷傷時，西方現代醫學將周邊神經斷傷的屬於外傷的一個環節。神經斷離的情況發生時，須在病人損傷急症穩定後，傷口清創完成後，才會進行神經修復手術。著眼於神經斷傷時，從外傷引起的主要病證中，古人對相關“神經斷傷”的認識與處理。神經斷傷在 44.

(53) 中醫的病證分類中，可屬於金瘡、骨折、脫位、筋斷、壓砸傷的範疇。中醫對各種“斷”的病證，有時也常用“絕”字來表示，如脈絕，筋絕，經脈絕等。西周春秋時，已有了創傷的病名《周禮記曲禮上》“頭有創則沐，身有瘍則浴”。“皮曰傷肉曰創骨曰折骨肉皆絕曰斷”。將外傷分為傷、創、折、斷四個不同概念。皮脈肉筋骨的損傷表現於皮膚上的就是“傷”，皮與肌肉裂開曰“創”；骨骼折斷曰“折”，皮膚肌肉筋骨都離斷曰“斷”[127, 128]. 。從中國歷代傷科、外科文獻中，對神經斷傷於中醫診治可囊括在金. 瘡、骨折、脫位、筋斷、壓砸傷等病證中。神經斷傷引起的神經功能喪失，神經幹無法復元的症狀，在相關病證雖有描述，但受限於當時對解剖的認知與治療的水準，無法對神經幹的斷離做特別的處置。中醫重視斷證的治療，骨折可接，筋斷可續，出血可止，對皮裂，筋斷，腸斷可縫合。2.6.1 節提及周邊神經可歸類於經脈的一部分，神經斷傷併大管血斷裂引起的病證，應屬於脈絕，筋絕，經脈絕等病證，中醫認為這些病證病情嚴重，治療困難，預後不佳。《諸病源候論》就有筋不得屈伸，痹不仁等金瘡後遺症的記載。隨著對神經系統的清楚認識，目前對周邊神經受損，醫師會重視周邊神經功能的恢復。在神經斷傷的治療部分，過去中醫雖無直接提及，但不容否認的是，從古代文獻中，中醫對斷證的治療是多方面的，包含傷口處理，手術縫合，針刺，中藥外敷內服等治療，於相關內容中，不難發現許多與神經斷傷的內容有關。. 45.

(54) 第三章. 材料與方法. 3.1 主要材料 3.1.1 製造神經導管 3.1.1.1 矽膠管(silicone) 實驗所用的矽膠管為 Helix Medical Silicone Tube，內徑 1.5 mm，外徑 1.96 mm，購自 Helix Medical, Inc (USA)。 3.1.1.2 明膠(gelatin) 實驗所用的明膠為 type A 型，自豬皮萃取而得，300 bloom number，購自 Sigma Chemical Co, St Louis, MO(USA)。 3.1.1.3 綠梔子素(genipin) 實驗所用之綠梔子素購自嘉年股份有限公司 (Challenge Bioproducts Co., Taichung, Taiwan)。 3.1.1.4 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide（EDC）實驗所用之 EDC 購自 sigma，E7750-25G ；USA。 3.1.1.5 N-hydroxysuccinimide（NHS）具穩定 EDC 結構功能，幫助交聯作用進行。實驗所用之 NHS 購自 Aldrich， 130672-100G ；USA。 46.

(55) 3.1.2 動物實驗 3.1.2.1 Toluidine Blue：神經髓鞘的染色劑實驗所用的 Toluidine blue 購自 Sigma (USA)。 3.1.2.2 9-0 Nylon 縫線用於將斷傷神經固定於神經導管。實驗所用的 9-0 Nylon 縫線購自 Mani (Japan)。 3.1.2.3 Betadine® Antiseptic Solution 用於實驗過程動物及器械的消毒。實驗所用的 Betadine® Antiseptic Solution 購自 Mundipharma (Germany)。 3.1.2.4 AErrane® 氣體麻醉劑，用於手術製模過程減低動物痛苦。實驗所用的 AErrane®(Isoflurane)購自 Baxter (USA)。 3.1.2.5 4-0 Catgut chrom 縫線用於縫合大鼠肌肉及皮膚。實驗所用的 4-0 Catgut chrom 縫線購自 B. Braun (Germary)。. 47.

(56) 3.1.3 組織研磨 3.1.3.1 組織研磨器 (Homolyzer) 3.1.3.2 Tissue lysis buffer Tris-base（USA，T8600；USA） EDTA（Sigma，E-5134；USA） β-mercaptoethanol （Pharmacia Bioetch，17-1317-01；Sweden） Glycerol（Angus，07-52305；USA） Protease inhibitor cocktail tablet （Roche，D68298；Switzerland）. 3.1.4 西方墨點法 3.1.4.1 Western blot buffer 40% Acrylamide /Bis Solution 29：1（MDBio，Inc.903039；USA） Solution B Tris-base（PH8.8）（USB，T8600；USA） Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma，S-5761；USA） Solution C Tris-base（PH6.8）（USB，T8600；USA） Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma，S-5761；USA） Ammonium persulfate （APS；Amresco，0486-25G；USA） TEMED （platinum Plus【CPG】，P-E90051） Glycine （USB，G-8165；USA） Glycerol （Angus，07-52305；USA） Methanol （台灣聯工，940103） 48.

(57) Tween 20 （Pharmacia Biotech，17-1316-01；USA） Sodium chloride (NaCl；Sigma，S-7653；USA） Ponceau S solution （Sigma，P-7170；USA） Blocking buffer（安佳脫脂奶粉；Anchor New Zealand Milk） Enhanced chemiluminescence（ECL）reagent（Santa Cruz Biotechnology，C2604； USA） 3.1.4.2 6× loading dye Bromophenol Blue (sigma，B-525；USA) β-mercaptoethanol (Pharmacia Biotech，17-1317-01；Sweden) Sodium dodeccl sulfate (SDS；Sigma，S-5761；USA) Glycerol (Angus，07-52305；USA) Tris-HCl (USB, T-8650；USA) 3.1.4.3 抗體（Antibody；Ab）本實驗所用之抗體如表 3.1 所示。表 3.1 抗體資料 1.st Ab. M.W.(KDa). 2.st Ab. 廠牌. 貨號. TGF-β. 25. mouse. MILLIPORE. MAB1032. GAP-43. 43-53. rabbit. abcam. Ab16053. synapsin I. 80/77. rabbit. CHEMICON. AB1543P. actin. 42. mouse. MILLIPORE. MAB1501. 49.

(58) 3.2 實驗方法 3.2.1 製造神經導管 3.2.1.1.未經交聯之神經導管製管步驟：以矽膠管為模，將其浸泡於 10%明膠中，第一次浸泡的時間為 5 分鐘，之後每次浸泡時間均 1.5 分鐘即可，兩次浸泡時間間隔 30 分鐘，讓剛附著的明膠可風乾而成型。反覆浸泡和風乾 8 次後，最後一次風乾時間拉長為 1 個小時，讓明膠成型且稍硬。. 3.2.1.2 ENG 製管步驟：將 3.2.1.1 所製成之未交聯導管充份浸泡於 0.032 M EDC/0.0128 M NHS 水溶液中 28 小時進行交聯。交聯後明膠顏色仍為透明無色。取出交聯後明膠，以逆滲透水浸泡 30 分鐘後，用逆滲透水反覆沖洗 10 次，最後在室溫中風乾數天，至管子變得乾硬且重量恆定後再抽出中間的矽膠管即得到中空的長管，切割成長度為 1.2 cm 的短管後，稱重並選取重量介於 0.0328±0.0033 g，管壁厚度均勻的管子為實驗可用之 ENG 神經導管。. 50.

(59) 3.2.1.3 GGC 製管步驟：將附著有明膠的矽膠管充份浸泡於 1%綠梔子素溶液中 1.5 小時進行交聯。交聯後明膠顏色由透明變成藍紫色。取出交聯後明膠，以逆滲透水沖洗 2 次後，用 95%酒精脫水 10 分鐘，最後在室溫中風乾數天至管子變得乾硬且重量恆定後再抽出中間的矽膠管即得到中空的長管，切割成長度為 1.2 cm 的短管後，稱重並選取重量介於 0.0320±0.0004 g，管壁厚度均勻的管子為實驗可用之 GGC 神經導管。. 51.

(60) 3.2.2 測定交聯度交聯指數代表了生物組織上自由胺基被交聯劑反應掉的百分率，此指數是利用 ninhydrin assay 來測量生物組織上未反應的自由胺基含量，公式如下：. 〔（NHN reactive amine）fresh－（NHN reactive amine）fixed〕. Fixation Index（%）=. ×100％（NHN reactive amine）fresh. 其中(NHN reactive amine) 而(NHN reactive amine). fresh. 為組織交聯前所含的自由胺基含量，. 則是組織在交聯後所剩餘的自由胺基含量。. fixed. 因為ninhydrin與自由胺基反應後會產生藍紫色的產物，我們利用了此顏色在570 nm波長的吸收度(OD值)與產物濃度成正比的關係，可以 ninhydrin與生物組織內自由胺基的反應量[129]，進而求得固定指數。反應機制如圖3.1所示[130]。. 52.

(61) 圖 3.1 ninhydrin 與自由胺基的反應機制[130] 在執行 ninhydrin assay 時，截取重量約 3 mg 的樣品，然後加入二次水將乾燥的組織浸泡約 1 小時，再加入 ninhydrin 試劑在 100 ℃下加熱約 20 分鐘，之後再使用 Microplate Reader (Model MRX, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Virginia, USA)在波長 570 nm 下，定量被處理過後生物組織內的自由胺基含量。. 53.