第五章 討論
5.3 組織切片與神經再生相關蛋白質表現量結果分析
過去本實驗室相關的實驗，在組織學定量分析中會對神經軸突數 目、神經軸突密度做進一步評估，但本實驗 GGC 組觀察到的神經切片 中再生神經較不成熟，再生軸突髓鞘化不明顯，無法清楚分辨並計數切 片下的神經軸突數目，故著重在以切片下細胞型態判斷神經成熟度。相 關蛋白質表現量分析則除了呈現單次西方墨點法結果外，也呈現了量化 後的統計結果。
silicone 組之再生神經最為成熟，幾乎無纖維疤痕組織存在
從型態上評估，我們認為 silicone 組的神經切片型態相對於較為成 熟，有神經外膜，圍神經膜，神經內膜等結構，整個再生神經的橫切面 皆佈滿神經組織，外圍幾乎沒有纖維疤痕組織。神經內膜中再生單元的 型態頗為成熟，有許多髓鞘化軸突及明顯的新生血管分布其中。
ENG 組再生神經成熟度較 silicone 組差，外圍存有纖維疤痕組織
ENG 組織再生神經型態也可以區分出神經外膜，圍神經膜，神經內 膜等構造，但神經內膜中新生血管數量明顯比 silicone 組少，且再生神 經橫切面中，神經組織只占中間小部分，外圍有寬度約0.46 mm 的纖維 疤痕組織。
GGC 組再生神經成熟度最差，亦有纖維疤痕組織包裹其外 者推論此現象較不利於再生軸突的生長[132]。Vleggeert-Lankamp 等使用 降解性材料 poly-(ε-caprolactone)（CL）製作神經導管修復大鼠坐骨神 經，結果顯示部分再生神經周圍都有纖維化結締組織，而較大孔洞組
（macropores, 10-230 μm）因纖維化結締組織較厚，反而降低軸突生長 的通透性，不利於神經再生[133]。
在本實驗中，降解性的兩種材料 ENG 及 GGC 所引發的周邊纖維化結締 組織增生遠比非降解性矽膠管組顯著，如何減少這些纖維化結締組織，
以及如何降低纖維化結締組織對神經再生的影響仍是重要的課題。
GAP-43 及 SynapsinΙ 表現量均為 silicone 組最多，ENG 組次之，GGC 組最少
實驗結果顯示，截斷八週後再生之坐骨神經中， GAP-43 之表現量 silicone 組最多，ENG 組次之，GGC 組最少。
GAP-43 為周邊神經再生時會大量表現之蛋白質。GAP-43 大量集中 在生長椎處，對於引導軸突再生扮演重要角色[97]，故許多研究者將 GAP-43 視為再生軸突的指標。Van der Zee[101]等推論 GAP43 的表現量可 反應出再生神經萌芽的數目（number of sprouts）；Ide[92]等指出 GAP43 有促進生長錐延伸（growth cone extension）的作用；Ohlsson[134]等在大 鼠視神經壓傷後再生的實驗中，就使用 GAP-43 抗體做組織免疫染色評 估軸突萌發情形。
綜上所述，GAP-43 可反應出神經再生生長錐和萌芽組織的生長情 況，回顧本實驗結果，表示 silicone 神經再生軸突的生長狀況最佳，ENG 組次之，GGC 組再生軸突的生長狀況最差，此結果和組織切片所顯示之 神經再生成熟度相符合。
另一與神經再生相關的蛋白質synapsin I 表現情況也是 silicone 組最 多，ENG 組次之，GGC 組最少。
synapsinΙ集中分布於髓鞘處[86]，周邊神經再生時亦會大量表現。
Akagi [87]等推論synapsin I和軸突的延長（axonal elongation）與突觸的形 成（synapse formation）等軸突的生成發育有關；Das[17]等提及synapsin I 的表現量與神經末端突觸成熟與否相關，進而推測synapsin I可用來當作 神經末端成熟的指標。Haastert[18]等在大鼠坐骨神經再生實驗中，即選 用synapsin I評估新生突觸成熟度。
實驗結果顯示，截斷八週後再生之坐骨神經中，synapsinΙ 之表現量 是silicone 組最多，ENG 組次之，GGC 組最少，此結果表示 silicone 組 神經末端突觸成熟度最佳，其次為ENG 組，GGC 組的神經末端突觸成 熟度最差，和我們在組織切片所看到的神經再生成熟度相符合。
降解性材料在植入動物體內後，不可避免的會釋出未交聯之交聯 劑，雖然Yamazaki[78]等在實驗中發現綠梔子素有引發PC12 細胞株神經 突分化的作用，但因為釋出之綠梔子素濃度無法控制， GGC 組 GAP-43 和 synapsinΙ 表現量差不排除是因為釋出之未交聯綠梔子素對神經的再 生產生不利之影響。
Silicone 組和 ENG 組的組織切片顯示 ENG 組之再生神經成熟度不 如silicone 組，GGC 組之再生神經成熟度更是與前兩組差距甚遠，但在 GAP-43 和 synapsinΙ 表現量分析上，卻只見 silicone 組和其他兩組有顯 著差異，ENG 組和 GGC 組卻未達統計之顯著差異，推論有以下幾個原 因：
首先，由組織學切片結果顯示，降解性的兩種材料 ENG 及 GGC 所 引發的周邊纖維化結締組織增生遠比非降解性矽膠管組顯著，再生組織 中，神經組織所占比率自然比 silicone 組低，故在進行組織研磨萃取蛋 白質時，神經組織蛋白質會被結締組織蛋白質稀釋，導致 ENG 及 GGC 的GAP-43 和 synapsin Ι 表現量相對不足。
另外，因活體內神經再生的過程其實是一連串很複雜的反應，且再 加上降解性神經導管的介入，使得再生神經周圍環境更加複雜，GAP-43 和 synapsin Ι 雖反應了軸突萌發和延長以及突觸成熟的情況，但也只能 部分反應神經再生狀況，再生過程中的其他機制無法單就此兩種蛋白質 的表現量來作解釋，因此組織學切片仍是重要的佐證。
再者，Kanabu[100]等分析 zebrafish 視神經斷傷後 GAP-43 隨時間的 表現量，發現於術後1-2 週 GAP-43 表現量會大增 12 倍；術後 4-8 週表 向量也增為4 倍。本實驗單只分析術後八週時的蛋白質表現量，若神經 導管材料對 GAP-43 和 synapsin Ι 表現量造成影響，或許連表現時間點 都受到影響，故應就各時間點分析 GAP-43 和 synapsin Ι 表現量，方能 反應全面的狀況。
TGF-β1表現量 EDC 組最多，GGC 組次之， silicone 組最少
由 2.7.3 節文獻討論可知，TGF-β1在神經再生過程中扮演雙向調節 角色。
先就 TGF-β1促進軸突萌發及生長之作用而言，本實驗中，GGC 為 降解性材料，在活體內被降解時可釋出未交聯之 genipin，而 Kitano 等 證實genipin 能抑制 TGF-β1基因的表現[84]，故 GGC 組再生神經 TGF-β1 表現量最低，這也可解釋組織切片觀察顯示 GGC 組再生神經之成熟度 最低。
又有文獻指出，當再生神經纖維長至損傷處的遠部斷端時，TGF-β1 的表現量隨即下降[105, 106]。由本實驗組織切片結果可知，在術後8 週時，
silicone 組及 ENG 組再生神經均已頗為成熟，故推測此時 silicone 組及 ENG 組之 TGF-β1 表現量主要來自再生神經外圍的發炎反應。Silicone 是非降解性材料，引發之發炎反應極低，而 ENG 組在材料降解的過程 中，持續的誘發發炎反應，發炎處的巨噬細胞、纖維母細胞等細胞均會 分泌TGF-β1，故TGF-β1表現量ENG 組遠大於 silicone 組，此一結果和 組織切片所見之纖維疤痕組織厚薄結果一致。
就 ENG 組及 GGC 組比較，GGC 組雖因 genipin 的抑制作用造成 TGF-β1表現量低於 ENG 組，但組織切片中 GGC 組再生神經周圍卻仍可 見到極厚的纖維疤痕組織，此結果和 Atkins 等的實驗結果不同。Atkins
等在 SD 大鼠坐骨神經斷端注入 TGF-β1及 TGF-β2的抗體，可有效的減 低纖維疤痕組織產生[122]，但因 Atkins 等的實驗中，大鼠坐骨神經截斷 後隨即縫合，而我們的實驗卻是植入了會持續刺激發炎反應的降解性材 料，慢性發炎過程中，有許多刺激生長的因子被釋放，除了TGF-β1，也 包括epidermal growth factor (EGF)、macrophage-derived growth factor (MDGF)以及 fibroblast growth factor (FGF)等，和纖維結締組織的產生均 有關，故即使TGF-β1表現量被抑制，仍有極厚的纖維疤痕組織產生。