附圖十三
4. 菌株的培養條件
4.1 大腸桿菌的培養條件
4.1.1 所使用的培養液、培養基以及藥品
4.1.1.1 所使用的培養液
本實驗中所使用的大腸桿菌之培養液有 Luria-Bertani (LB)培養液[1%
Tryptone (BactoTM), 1% NaCl (USB), 0.5% Yeast Extract (BactoTM), pH7.2~7.4]、含有 50~100 μg/ml ampicillin 抗生素之 LB 培養液、含有 25~50 μg/ml kanamycin 抗生素之 LB 培養液、SOB 培養液[2% Tryptone (BactoTM), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, pH 7.2~7.4]，以及 SOC 培養液(980 ml SOB 培養液＋
10 ml 2M MgSO4‧7H2O＋10 ml 2M glucose)。
4.1.1.2 所使用的培養基
所使用的大腸桿菌培養基有 LB 培養基[1% Tryptone (BactoTM), 1%
NaCl (USB), 0.5% Yeast Extract (BactoTM), 1.5% Agar (BactoTM), pH 7.2~7.4]、含有 50~100 μg/ml ampicillin 抗生素之 LB 培養基，以及含有 25~50 μg/ml kanamycin 抗生素之 LB 培養基。
4.1.1.3 所使用的藥品
所使用的藥品有進行藍白篩選的 X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl -β-D-galactopyranoside)，每盤固態培養基需 40 μl 的 40 mg/ml X-Gal；和誘 導重組蛋白質大量表現的IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)，貯存 的濃度配製為1M。
4.1.2 一般大腸桿菌的培養
一般大腸桿菌的培養，會以 LB 的培養液或是培養基進行培養；若大腸 桿菌帶有質體時，會依照質體上所帶有的抗生素基因，而選擇含有合適的抗 生素之 LB 培養液或是培養基來培養。在轉形實驗中，則會以 LB 或是 SOC 培養液培養，使細菌恢復；而在 TA 轉殖中，會使用含有 X-Gal 的固態培養 基，進行藍白篩選。此部份，已於 3.1 大腸桿菌品系的建構的各項中有詳細 的敘述。
4.1.3 表現重組蛋白質之菌株的培養條件
由 於 pET 系 列 的 載 體 (Novagen) 含 有 lacI 的 轉 譯 序 列 和 pET
cloning/expression 區域，且 pET cloning/expression 區域內含有 lac 操作子(lac operator)，multiple cloning sites (MCS)，以及許多 Tag 的轉譯序列(如 S‧Tag、
Trx‧Tag 、 His‧Tag… 等 的 轉 譯 序 列 ) ； 所 以 可 以 利 用 IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)，以及在大腸桿菌 BL21 的系統下，來誘導所要之 重組蛋白質的大量表現。而本實驗所使用的pET 系列的載體為 pET-29b(+)，
並且將會利用His‧Tag 的轉譯序列來製備所要的 6xHis-Tagged CaCdc4 重組 蛋白質。
重組蛋白質的表現，會因為所欲研究的蛋白質不同，而其所需的誘導溫 度、時間，以及IPTG 之濃度也會有所不同，所以將會先測試重組蛋白質在各 個誘導條件下的表現情形，以進而找出最佳的誘導條件。首先將帶有表現重 組蛋白質之載體的大腸桿菌菌株BL21 接種到三管 2~3 ml 含有合適抗生素之 LB 培養液中，於 37℃培養至隔天。隔日，各取 2 ml 的菌液加入 500 ml 含有 合適抗生素之 LB 培養液中，於 37℃以 200 rpm 搖晃培養至 OD595 之值為 0.6~0.8 (大約需要兩個小時的培養)。待 OD 值到達時，將菌液以每 3 ml 分裝 成一管，並加入不同的IPTG 濃度(0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mM)，於不同 的溫度(25，30，37℃)和時間點(0，1，2，3，4，5，6，8 hrs)誘導重組蛋白 質的表現。將在不同溫度與時間點下所收的菌液，各取 500 μl 出來，於 4℃
中以13,000 rpm 離心一分鐘，去除上清液，加入 1x SDS sample buffer (20 mM Tris-HCl pH 6.8, 1.4% SDS, 4% glycerol, 0.02% bromophenol blue)於菌體中，於 95℃ 加 熱 五 至 十 分 鐘 ， 接 著 各 取 20 μl 跑 SDS 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳 (SDS-PAGE)，並以 coomassie blue 染色，和西方點墨法分析(western Blotting)，
以找出最佳誘導重組蛋白質的條件。
經過測試後，以0.5 mM 之 IPTG 於 25℃下誘導 6xHis-tagged CaCdc4 重 組蛋白質三個小時的條件為最適當。誘導 30 ml 的菌液表現後，將全部的菌 液以 4℃，3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，去除上清液後，再加入 10 ml
pH7.5)清洗菌體，混合均勻後，以每 1 ml 分裝成一管，共十管，再以 4℃，
13,000 rpm 離心一分鐘，將上清液去除乾淨，並將菌體保存於-80℃中，或立 即進行重組蛋白質之萃取與純化，以將作為一份細胞外之蛋白質交互作用以 及His-tagged 重組蛋白質和與其相關的蛋白質之純化的樣本。