附圖十三
4. 菌株的培養條件
4.2 白色念珠菌的培養條件
4.2.1 所使用的培養液、培養基以及藥品
4.2.1.1 所使用的培養液
本 實 驗 所 使 用 的 白 色 念 珠 菌 培 養 液 有 YPD 培 養 液 [2% Peptone (BactoTM), 1% Yeast Extract (BactoTM), 2% Glucose (ZYMESET), pH 5.4~5.6]、YPD＋10% serum 培養液[2% Peptone (BactoTM), 1% Yeast Extract (BactoTM), 2% Glucose (ZYMESET), 10% serum, pH 7.2]、SC-ura 培養液 [0.67% Yeast nitrogen base without amino acid (Sigma), 0.192% Yeast synthetic drop-out media supplement without uracil (Sigma), 2% Glucose (ZYMESET)]，
以及 SD＋Arg＋His 培養液[0.67% Yeast nitrogen base without amino acid (Sigma), 0.36mM Arginine (Sigma), 0.5mM Histidine (Sigma), 2% Glucose (ZYMESET)]。
4.2.1.2 所使用的培養基
所使用的白色念珠菌培養基有YPD 培養基[2% Peptone (BactoTM), 1%
Yeast Extract (BactoTM), 2% Glucose (ZYMESET), 2% Agar (BactoTM), pH 5.4~5.6]和 SC-ura 培養基[0.67% Yeast nitrogen base without amino acid (Sigma), 0.192% Yeast synthetic drop-out media supplement without uracil (Sigma), 2% Glucose (ZYMESET), 2% Agar (BactoTM)]。
4.2.1.3 所使用的藥品
所使用的藥品為誘導重組蛋白質之表現的doxycycline (Sigma)，其貯存 的濃度配製為40~50 mg/ml。
4.2.2 一般白色念珠菌的培養
一般白色念珠菌的培養，會以YPD 培養基或是培養液進行培養；而在進 行篩選的過程中，會依照菌株是否帶有外來營養基因而恢復本身營養缺現型 的外表形，來選擇合適的營養缺陷之培養液或是培養基(本實驗中所使用的為 SC-ura 培養基和培養液)。在醋酸鋰酵母菌轉形實驗中，會以二次水或是 SD
＋Arg＋His 培養液進行回溶菌體。此部份，已於 3.2 白色念珠菌品系的建構 的各項中有詳細的敘述。
4.2.3 表現重組蛋白質之菌株的培養條件
本實驗是利用 TET-on 系統來誘導所欲研究的重組蛋白質於白色念珠菌 中大量表現。pTET25M (見 P.87 附圖十四)載體含有 ADH1 promoter，Candida albicans reverse Tet-dependent transactivator (CarTA)的轉譯序列，以及 tet 操作 子(tet operator)。由於 ADH1 promoter 可以持續性地表現 CarTA，而當 CarTA 和doxycyclin 相結合時，便可以與 tet 操作子相結合，以啟動下游基因的表現；
所以將欲研究的重組蛋白質之轉譯序列置於 tet 操作子的下游，以製備出 pTET25M-欲研究的重組蛋白質之轉譯序列的質體，並將此質體嵌入白色念珠 菌BWP17 的 ADH1 基因座上，即可利用 doxycyclin 來誘導所要的重組蛋白之 大量表現(見 P.91 圖十) (Park and Morschhauser, 2005)。
重組蛋白質的表現，會因為所欲研究的蛋白質不同，而其所需的誘導時
形，以進而找出最佳的誘導條件。首先將帶有表現重組蛋白質之基因的白色 念珠菌菌株，以及BWP17 (以作為對照組)，各接種於 3 ml 的 YPD 培養液中，
於30℃培養至隔天。隔日，將此 3 ml 的菌液各加入於 50 ml 的 YPD 培養液 中，並於30℃以 200 rpm 搖晃培養至 OD600 為 0.6~0.8 之間(大約需要二至三 個小時的培養)。待 OD 值到達時，將各 50 ml 的菌液以每 3 ml 分裝成一管，
且每兩管菌液為一組，其中一管加入 40~50 μg/ml 的 doxycycline，而另一管 並不加入doxycycline，以作為對照組；接著將每組菌液置於 30℃中培養，並 於各個的時間點(0，2，3，4，5，6，8 hrs 以及 O/N)收取各組菌液，然後將 所收取的菌液，以4℃、13,000 rpm 離心一分鐘，去除上清液後，每管再加入 1 ml 的 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.5)清洗菌體，再以 4℃、13,000 rpm 離心一分鐘，將上清液去除乾淨，並 將菌體保存於-80℃中，待進行白色念珠菌蛋白質之萃取，與西方點墨法分析 (western blotting)，以找出最佳誘導重組蛋白質的條件。
經 過 測 試 後 ， 以 40~50 μg/ml 的 doxycycline 於 30℃ 下 誘 導 6xHis-FLAG-tagged CaCdc4 重組蛋白質六個小時的條件為最適當。誘導 200 ml 的菌液表現後(需做兩次的事先培養，第一次先培養 4 ml 的菌液至隔天，
再取1 ml 的菌液出來，進行 20 ml 的事先培養至隔天，接著再取 15 ml 的菌 液加入200 ml 的 YPD 中，以進行重組蛋白質的誘導)，將全部的菌液以 4℃、
3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，去除上清液後，以 1x PBS 清洗菌體兩次，
再以 4℃、3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，將上清液去除乾淨，並將菌體 保存於-80℃中，或立即進行重組蛋白質之萃取與親和力蛋白質之實驗。
4.2.4 誘導白色念珠菌之形態生成的培養條件
4.2.4.1 SC5314 之酵母菌和真性菌絲生長形態的誘導
取單一顆SC5314 的菌落接種於 4 ml 的 YPD 培養液，並於 30℃培養至
隔天。隔日，再將此4 ml 的菌液，各取 2 ml 出來分別加入 30 ml 的 YPD 培 養液(pH 5.4~5.6)中，於 30℃培養箱，200 rpm 搖晃培養兩個小時，以誘導 酵母菌生長形態的形成；以及30 ml 的 YPD＋10% serum 培養液(pH 7.2)中，
於37℃培養箱，200 rpm 搖晃培養兩個小時，以誘導真性菌絲生長形態的生 成。待兩個小時候，將兩種誘導形態的菌液分別以 4℃、3,000~4,000 rpm 離 心五到十分鐘，去除上清液後，以1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.5)清洗菌體一次，再以 4℃、3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，將上清液去除乾淨，並將菌體保存於 -80℃中，或立即 進行重組蛋白質之萃取與親和力蛋白質之實驗。另外，在誘導 SC5314 形成 酵母菌生長形態，和形成真性菌絲生長形態之前和之後，可以取少量的菌液 出來，以Nikon 50i 三眼相位差顯微鏡觀察其形態是否大部分為酵母菌的生 長形態，和真性菌絲的生長形態。
4.2.4.2 TET-On 系統菌株之酵母菌和真性菌絲生長形態的誘導
本研究中，TET-on 系統的誘導重組蛋白質之表現，與酵母菌生長形態 的誘導為同步進行；或是先誘導形態的形成，再進行重組蛋白質的誘導：前 者是將經由兩次事先培養後的菌液，再轉換至200 ml 的 YPD 培養液中(詳 見4.2.3 表現重組蛋白質之菌株的培養條件)，共兩份，經過 1.5~2 小時的細 胞恢復後，皆直接以40~50 μg/ml 的 doxycycline 來誘導重組蛋白質的表現，
且同時將其中一份菌液於YPD 培養液(pH 5.4~5.6)，30℃的環境下，誘導酵
母 菌 生 長 形 態 的 形 成 ； 而 另 一 分 菌 液 則 於 YPD ＋ 10% serum 培 養 液 (pH 7.2)，37℃的環境下，誘導真性菌絲生長形態的形成。後者是將經由兩
次事先培養後的菌液，再分別轉換至200 ml 的 YPD 培養液(pH 5.4~5.6)和 YPD＋10% serum 培養液(pH 7.2)，並分別於 30℃和 37℃的環境下，處理菌 株兩個小時，以分別誘導酵母菌生長形態與真性菌絲生長形態的形成；接
著，再以以40~50 μg/ml 的 doxycycline 來誘導重組蛋白質的表現。待六個 小時誘導重組蛋白質之表現結束後，將全部的菌液以4℃、3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，去除上清液後，以1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.5)清洗菌體兩次，再以 4℃、
3,000~4,000 rpm 離心五到十分鐘，將上清液去除乾淨，並將菌體保存於 -80℃中，或立即進行重組蛋白質之萃取與親和力蛋白質之實驗。