綜觀性比較與整合各個細胞內 Elution 的銀染結果

11.1.1 綜觀性分析與 CaCdc4 的 F box 和 WD40 domain 之相關性蛋白

質分子量的銀染

Patterns

首先將先觀察於酵母菌的生長形態下，分別利用 CaCdc4-F box-6HF 和 CaCdc4-WD40-6HF 所找到的相關性蛋白質之銀染結果，且將把銀染的 SDS-PAGE 跑膠圖分為 A、B、C 和 D 四個部分來做比較與分析：由圖二十六 B 之 A 部分可以發現，利用 CaCdc4-F box-6HF 和 CaCdc4-WD40-6HF 所找到 的相關性蛋白質(以下將分別簡稱 F 組和 W 組)，雖然可以在以 BWP17 為背 景值中(以下將簡稱 B 組)找到相對應的 bands，可是 band (1)和(2)於 W 組中有 觀察到，而F 組中則沒有；另外，band (3)只有在 B 組中有出現，F 與 W 組 則沒有。圖二十六B 之 B 部分，相較於對照組 B 組的 band (6)，F 組的 band (4) 雖然深度較淺，但也比W 組的 band (5)來得深；此外也同樣對照於 B 組的 band (10)，可以觀察到 F 組的 band (8)較呈現微弱的 smear 情形，且於 smear 上的 band (7)則是 F 組所特有的，而於 W 組的 band (9)則較 band (10)明顯。圖二十 六B 之 C 部份，分子量介於 40~50 kDa 之間的 a 與 b，以及介於接近 33 kDa 的e 與 f，其蛋白質的表現深度在 F 組是為最淡的，而 W 和 B 組則是較為明 顯的；靠近分子量 40 kDa 的 c，其蛋白質只有在 W 和 B 組中有發現，而 F 組則是沒有的；分子量介於33~40 kDa 的 d 上，在 F、W 和 B 組中皆有觀察 到蛋白質存在，只是在F 組上的 band (12)較呈現微弱的 smear 情形，且在其 上的band (11)為 F 組特有的；而 band (13)與 smear (14)則是 W 組特有的。圖 二十六B 之 D 部分，相較於對照組 B 組 band (17)，F 組的 band (15)較微弱，

而W 組的 band (16)則更為明顯；接近 24 kDa 的分子量 g 和 h，以及介於 17~24 kDa 之間的 i，在 F、W 和 B 組中皆有觀察到蛋白質存在，只是 F 組較 W 組

A

Yeast form Hyphal form

CaCdc4

Yeast form Hyphal form

CaCdc4

Yeast form Hyphal form

CaCdc4

Yeast form Hyphal form

CaCdc4

Yeast form Hyphal form

CaCdc4

將cell lysates 直接從已經過 doxycycline 與酵母菌和真性菌絲形態誘導的 TET-CaCDC4/CaCDC4-F box (F)/CaCDC4-WD40 (W)-6HF 菌株中抽取出來，再利用anti-FLAG-M2 affinity gel 進行純化，最後將純化過程中的 elution 部分，以銀染的方式進行蛋白質的呈現。

C. 利用製備好的 CaCdc4-6xHis-Ni-Resin (R)分別與酵母菌(YR)以及真性菌絲(HR)的 cell lysates 進行細胞外的蛋白質交互作用，並 以銀染的方式呈現與CaCdc4 的相關性蛋白質。B 是以 BWP17 作為對照組，(-)和 NR 皆是以 NP40 lysis buffer 作為負對照組。

A B C

明顯；位於接近分子量17 kDa 的 j，W 和 B 組有發現到蛋白質，但是 F 組則 是沒有的；最後可以觀察到band (20)是 F 組特有的。

接下來，我則以於酵母菌的生長形態下，分別利用CaCdc4-F box-6HF 和 CaCdc4-WD40-6HF 所找到的相關性蛋白質之銀染結果，為主要的對照組，以 於真性菌絲的生長型態下，找出與酵母菌組中不同的 CaCdc4-F box 和 CaCdc4-WD40-6HF 之相關性蛋白質：由圖二十六 B 之真性菌絲組的 A 部份，

可以觀察到F 與 W 組的蛋白質 patterns 和在酵母菌組中的形式是相同的，除 了F 組的 band (21)和 W 組的 band (22)為真性菌絲組中才有發現的，雖然仍可 以在B 組對照組中找到相對應的 band。於圖二十六 B 之真性菌絲組的 B 部份 可以觀察到很有趣的變化現象，於酵母菌F 組中可以觀察到的 band (4)與(7)，

卻在真性菌絲組中消失了，且原本於酵母菌中較為模糊的smear (8)，卻於真 性菌絲中明顯的存在，此為band (23)；而在真性菌絲 W 組中的 band (24)和酵 母菌組中的band (9)一樣，仍是存在著；另外，在靠近分子量 55 kDa 的 k 上，

雖然於B 組中可以找到相對應的 band，可是此位置上的蛋白質卻只有在真性 菌絲組中有出現，酵母菌組中則沒有。圖二十六B 之真性菌絲組的 C 部份，

和酵母菌組的 C 部分不一樣之處為原本位於分子量 a 和 c 上的 bands 是沒有 觀察到的；而最大明顯的不同是W 組中的 band (25)較酵母菌組的明顯。圖二 十六 B 之真性菌絲組的 D 部份，可以觀察到原本在酵母菌 F 組中較明顯的 band (15)，在菌絲組中相對應的 band (26)反而變得較不明顯了，且原本於酵 母菌W 和 B 組中的 band (18)和(19)，在真性菌絲組中反而消失了。

11.1.2 綜觀性分析與 CaCdc4 以及其 F box 和 WD40 domains 之相關性

蛋白質分子量的銀染

Patterns

全長的 CaCdc4 於白色念珠菌中，為不穩定存在的蛋白質，而相較之下，

把CaCdc4 分成兩部分的 domains，F box 以及 WD40，則是較為穩定存在於

白色念珠菌中的形式。由於全長的 CaCdc4 是不穩定存在於細胞中的，所以 在尋找與其相關性的蛋白質中，可能會因為蛋白質的不穩定而遺失了可能的 相關性蛋白質；但也有可能會因為F box 和 WD40 domains 的構形產生改變，

或是缺乏轉譯後修飾的調節，而所找到的相關性蛋白質並不為與 CaCdc4 相 關的蛋白質。因此，接下來，想藉由利用 CaCdc4-6HF 所找到的相關性蛋白 質(以下將簡稱 CaCdc4 組)，與以 CaCdc4-F box-6HF 和 CaCdc4-WD40-6HF 所找到的相關性蛋白質之銀染結果相互比較，希望可以找到相同或是相異的 部份：由圖二十六A 之 A 部分，可以發現酵母菌與真性菌絲 CaCdc4 組的蛋 白質分子量之 patterns，會和相對應的 F 與 W 組不同。而令我覺得有趣的部 份是在圖二十六A 之 B 部份中，CaCdc4 組的 band (27)、(28)和(29)，分別和 F 組的 band (7)、(8)和(23)是有相同的變化結果；和在圖二十六 A 之 C 部份中，

CaCdc4 組中的 band (30)與(31)，也和 F 組中位於分子量 b 的 bands 具有相同 的變化；以及在圖二十六A 之 D 部份中，CaCdc4 組的 band (32)和(33)，與(34) 和(35)，分別和 F 組 l 與 g 分子量之相對應 bands 有相類似的變化結果。另外，

和W 組位於分子量 j 的 band (18)以及其於真性菌絲組相對應的位置，也可以 在CaCdc4 組中找到相似的變化 pattern，即位於圖二十六 A 之 D 部份分子量 m 酵母菌組中的 band (36)，以及相對應真性菌絲組的位置。