親和力蛋白質之純化(Affinity Purification)

7.1 利用大腸桿菌 BL21 表現重組蛋白質系統

7.1.1 製備含有 His-Tagged 重組蛋白質之 Nickel Resin

將經過 IPTG 誘導重組蛋白質表現的大腸桿菌之 cell lysates，以每 1 ml 分裝成一份，共兩份，以進行製備含有His-tagged 重組蛋白質之 nickel resin。

首先將HIS-Select Nickel Affinity Gel (Sigma)輕微地震盪，以將 nickel resin 混 合均勻，並各取 50 μl 的混合液於新的 1.5 ml 離心管中[HIS-Select Nickel Affinity Gel (Sigma)是以 30%的 ethanol 進行保存，且其 nickel resin 的濃度為 50%，因此所取的 50 μl 的 HIS-Select Nickel Affinity Gel，實際上約只含有 25 μl 的 nickel rein]，共兩管。然後以 4 ℃、5,000 ×g 離心三十秒至一分鐘，

將保存nickel resin 的 ethanol 給去除掉。接著各管再加入 200 μl 不含 imidazole 的equilibration buffer (50 mM NaH2PO4, 0.3 M NaCl)，輕微地震盪混合均勻，

以進行nickel resin 的平衡作用，再以 4℃、5,000 ×g 離心三十秒至一分鐘，去 掉上清液。接下來，各管nickel resin 各加入 1 ml 上述經過 IPTG 誘導重組蛋 白質表現之大腸桿菌的 cell lysates，置於 4℃中，進行一至兩個小時的 His-tagged 重組蛋白質與 nickel resin 之結合作用。然後再以 4℃、5,000 ×g 離

NaH2PO4, 0.3 M NaCl)清洗兩次(而在第一次清洗時，就將 His-tagged 重組蛋白 質-Ni-resin 分裝成四等分，其中一份將作為對照組所用，剩餘的三等分將進 行後續的細胞外蛋白質之交互作用，所以平均一份的細胞外蛋白質交互作 用，是以7.5 ml 的大腸桿菌表現系統之菌液所抽取出的 cell lysates 進行的)，

每次以4℃、5,000 ×g 離心三十秒至一分鐘，並去除上清液，便完成了製備含 有His-tagged 重組蛋白質之 nickel Resin。

7.1.2 細胞外之蛋白質交互作用

將所誘導成酵母菌與真性菌絲形態的白色念珠菌SC5314，各以 15 ml 的 菌液量，進行白色念珠菌的蛋白質之萃取，而所抽取的cell lysates (約 1.5 ml) 將與上述所製備好的含有His-tagged 重組蛋白質之 nickel Resin，於 4℃的環 境下，進行細胞外的蛋白質交互作用至隔天。而其中一份的 His-tagged 重組 蛋白質-Ni-resin 將會和 1 ml 的 NP40 lysis buffer 進行作用，以作為 His-tagged 重組蛋白質-Ni-resin 的背景值。

7.1.3 His-Tagged 重組蛋白質和與其相關的蛋白質之純化

接著，將進行與 His-tagged 重組蛋白質的相關性蛋白質之純化，以 wash buffer (50 mM NaH2PO4, 0.3 M NaCl)清洗完成細胞外蛋白質交互作用的 His-tagged 重組蛋白質-Ni-resin 兩次，以及以含有 250 mM imidazole 的 elution buffer (250 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 0.3 M NaCl)進行兩次 elution 的動 作，且每一次的清洗與elution 後，皆以 4℃、5,000 ×g 離心三十秒至一分鐘，

並將上清液移除。最後，再將純化過程中的產物，input、flow through/F、wash 1/W1、wash 2/W2、elute 1/E1、elute 2/E2 和 resin/R 部份，加入 5x SDS sample buffer (0.1 M Tris-HCl pH 6.8, 7% SDS, 20% glycerol, 0.1% bromophenol blue) (resin/R 部分則以 1x SDS sample buffer 處理)，於 95℃加熱五至十分鐘，以進

行西方點墨法與銀染的分析。並將 elution 或是 resin 的部分以蛋白質分子量 patterns 的比較，找到可能的 His-tagged 重組蛋白質的相關性蛋白質，以便於 之後以質譜儀來鑑定其蛋白質身分。

7.2 利用白色念珠菌表現重組蛋白質之系統

7.2.1 FLAG-Tagged 重組蛋白質和與其相關的蛋白質之純化

我以每200 ml 經過 40~50 μg/ml doxycycline 誘導重組蛋白質表現，以及 形態誘導的菌液量，所抽取出的cell lysates (約有 1 mg 的蛋白質量)，進行一 份 的 FLAG-tagged 重 組 蛋 白 質 和 與 其 相 關 的 蛋 白 質 之 純 化 。 首 先 將 Anti-FLAG-M2 Affinity Gel (Sigma)輕微地震盪，使 resin 均勻地混合於保存溶 液中[Anti-FLAG-M2 Affinity Gel (Sigma)是以 50% glycerol，10 mM sodium phosphate，150 mM sodium chloride, pH 7.4 以及 0.02% (w/v) sodium azide 進行 保存，且其resin 的濃度為 50%，因此所取的 Anti-FLAG-M2 Affinity Gel 混合 液的量，實際上約只含有一半的 rein 量]，接著取適量的 resin 出來於新的 1.5 ml 離心管中(上述每 200 ml 的菌液量所抽取出的蛋白質，以 50 μl 的 resin 量進行純化)，並以 4℃、5,000~8,200 ×g 離心三十秒至一分鐘，靜置 resin 一 至兩分鐘，使其沉降下來，然後再將上清液去除掉。再以0.5 ml 1x TBS (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)清洗 resin 兩次，並以 4℃、5,000~8,200 ×g 離 心三十秒至一分鐘後，去除上清液。為了要去除沒有與gel 相結合的 anti-FLAG 抗體，所以將會以0.5 ml 0.1 M glycine-HCl, pH 3.5 進行 resin 的清洗(切記：

不要將resin 置於 glycine-HCl 超過二十分鐘)，然後再以 0.5 ml 1x TBS (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) 清洗 resin 三次，而此步驟是可以選擇性來操 作的。

接 著 ， 將 cell lysates 自各個菌株中抽取出來，再分別與清洗好的 Anti-FLAG-M2 Affinity Gel，於 4℃的環境下，進行兩個小時或至隔日的結合

作用。然後，於4℃下，以含有 150 mM NaCl 的 1x TBS (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)清洗完成結合作用的 Anti-FLAG-M2 Affinity Gel 三次，

每次十五分鐘，清洗完後，皆以4℃、5,000~8,200 ×g 離心三十秒至一分鐘，

去除上清液。再以含有300 mM NaCl 的 1x TBS (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl)清洗兩次，每次十五分鐘，清洗完後，皆以 4℃、5,000~8,200 ×g 離心三十秒至一分鐘，去除上清液。接下來，再以100 μl 的 150 ng/μl 3x FLAG peptides (Sigma)，進行一份的 FLAG-tagged 重組蛋白質和與其相關的蛋白質 之 elution 的動作，此過程需於 4℃中進行三十分鐘的反應。最後，將純化過 程中的input、elute/E 和 resin/R 部份，加入 5x SDS sample buffer (resin/R 部分 則以1x SDS sample buffer 處理)，於 95℃加熱五至十分鐘，以進行西方點墨 法和銀染分析。並將elution 或是 resin 的部分以蛋白質分子量 patterns 的比較，

找到可能的 His-tagged 重組蛋白質的相關性蛋白質，以便於之後以質譜儀來 鑑定其蛋白質身分。