附圖十三
3.2 白色念珠菌品系的建構
由於出芽酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的醋酸鋰轉形實驗已有建構完
基於出芽酵母菌的方法而來，但其轉形的效率卻不如出芽酵母菌來得好，每1 μg 的線性DNA約只能得到50~100個轉形白色念珠菌(Sanglard et al., 1996)。而若將 熱休克的溫度從原本的42℃提高至44℃，並且將醋酸鋰處理細胞的時間由半個 小時延長至隔夜，可提高白色念珠菌的轉形效率，每1 μg的線性DNA約可以得 到400~500個轉形白色念珠菌(Walther and Wendland, 2003)。故本研究中，所使 用的醋酸鋰酵母菌轉形實驗，將會提高熱休克的溫度至44℃，以及延長醋酸鋰 處理細胞的時間至隔天，希望可以提高白色念珠菌的轉形效率，進而得到所要 的菌株。
3.2.1 將進行醋酸鋰酵母菌轉形實驗的 DNA 片段之準備
首先從-80℃所保存的大腸桿菌菌株中，輕輕刮取少許的菌塊種於 50 ml 的LB 培養液 (含有合適的抗生素)中，置於 37℃培養箱震盪培養至隔天。隔 日，以Gene-SpinTM MiniPrep Purification Kit-V2 (Protech Technology)抽取質 體，每5 ml 的菌液量抽取成一管(由於每一個 Gene-Spin 的離心管柱，最多可 以抽取5 ml 的菌液量，所以為了達到最佳的效率，以每 5 ml 的菌液量抽取成 一份質體)，共十管，每管質體各以 50 μl 的二次水回溶；接著將每份抽取好 的質體，加入合適與適量的限制酶(每份質體約加入 10 units 即可)與其作用六 個小時或至隔天。六個小時候或至隔日，以電泳分離線性DNA 片段後，利用 Gel-MTM Gel Extraction System (VIOGENE)回收出欲進行醋酸鋰酵母菌轉形 實驗的DNA 片段，所回收的 DNA 片段共以 150 μl 的二次水回溶，並以 30 μl 的量(約含有 1~5 μg 的 DNA)作為一份欲進行醋酸鋰酵母菌轉形實驗的 DNA 片段，因此共可以得到五份欲轉形的DNA 片段。
3.2.2 醋酸鋰酵母菌轉形實驗(LiAc Yeast Transformation)
首先從-80℃所保存的白色念珠菌菌株中，取一點菌液於 YPD 固態培養
基上劃開，並至於30℃培養箱中，培養一至兩天，待其單一顆菌落長出。接 著挑出單一顆菌落種於含有2 ml YPD 液態培養液的養菌管中，於 30℃中培 養至隔日；而剩餘所劃開的菌落，可以保存在 4℃裡，待下次轉形時使用。
隔天，將此2 ml 的菌液置於 50 ml 的 YPD 液態培養液裡，於 30℃中培養至 OD600 之值約為 1.0 (大約需要三到四個小時的培養時間)。待 OD600 之值到 達1.0 後，將菌液分裝至 50 ml 的高速離心管中，共兩管，便以 3,000 rmp 離 心五分鐘。接下來，將上清液去除，並每管加入 10 ml 的無菌二次水清洗一 次，再離心3,000 rmp 五分鐘，然後將上清液去除，每管 pellets 各加入 1.5 ml 的1x TE/LiAc (300 μl 10x TE + 300 μl 10x LiAc + 2.4 ml d2H2O)回溶，並使其 均勻懸浮。接著將此已經醋酸鋰處理過的白色念珠菌菌株，以100 μl 分裝成 一管，成為一份的轉形樣本。取 1~5 μg 欲轉形的 DNA 片段(上述 3.2.1 將進 行醋酸鋰酵母菌轉形實驗的DNA 片段之準備實驗中，所得到的每一份 30 μl 欲轉形之 DNA 片段)，加入於 10 μl 10 mg/ml 的單股鮭魚精子 DNA/salmon sperm DNA (使用前先分裝欲轉形的數量於 PCR 試管當中，每份轉形樣本需 100 μg，於 PCR 機器中以 95℃十分鐘，4℃十分鐘，4℃∞處理，使其 denature 成單股形式，並於4℃中保持其單股的形式)當中，稍微混合均勻，至於冰上，
待酵母菌轉形所用。而相對於酵母菌來說，必須靠單股的鮭魚精子DNA 作為 攜帶者，將欲轉型的DNA 送入酵母菌中。配製 40% PEG3350 / 1x TE / 1x LiAc，每份轉形樣本需 600 μl (480 μl 50% PEG3350 + 60 μl 10 xTE + 60 μl 10x LiAc)。待經醋酸鋰處理過的白色念珠菌菌株，欲轉形的 DNA 和單股鮭魚精 子DNA 混合液，以及 40% PEG3350 / 1x TE / 1x LiAc 溶液準備好後，將一份 的欲轉形之DNA 和單股鮭魚精子 DNA 混合液，加進一份的經醋酸鋰處理過 的白色念珠菌菌株，接著再將一份的40% PEG3350 / 1x TE / 1x LiAc 溶液置 入進去，稍微震盪一下，放於30℃培養箱中震盪培養至隔夜。隔天，將其換 至44℃熱休克十五分鐘，結束之後再快速離心五秒鐘，將上清液去除掉，接
～200 μl 的二次水(或是 SD＋Arg＋His 的液態培養液)回溶，並利用過火和冷 卻過的玻璃棒，或是滅過菌的玻璃珠，將菌液塗於可篩選用之固態培養基上，
然後置於30℃培養箱中培養四到五天。
3.2.3 複印(Replica)
將醋酸鋰酵母菌轉形成功的菌落，分別於YPD 固態培養基上劃開，並至 於30℃培養箱中培養一到兩天，以作為簡單的保存與後續分析菌株基因型的 正確性所用。待於YPD 固態培養基上劃開的菌落長出後，將進行兩個世代的 複印，以篩選出穩定態之基因型的菌株。取兩張滅過菌的濾紙平放於圓木柱 上，並以橡皮筋將濾紙固定於上，接著將上述的YPD 固態培養基倒蓋在圓木 柱上，將培養基固定好，並垂直輕拍固態培養基的背面，使YPD 固態培養基 上的菌落均勻地沾粘在濾紙上，再輕緩地將培養基拿起。接下來，將可篩選 用的固態培養基覆蓋在已沾有菌落的濾紙上，垂直輕拍固態培養基的背面，
並施力均勻地把菌落複印到培養基上，再以垂直的方向快速地將培養基拉 起；接著再換新的YPD 固態培養基，以同樣的方式將菌落複印於上；再將原 本的 YPD 固態培養基，沾有菌落的可篩選用之培養基，以及新複印的 YPD 固態培養基置於30℃培養箱中培養一到兩天。此沾有菌落的可篩選用之培養 基，以及原本的 YPD 培養基為第一個世代的複印；而新複印的 YPD 固態培 養基為第二個世代的複印， 待其菌落長出後，再以上述相同的方法，將菌落 複印至新的可篩選用的培養基上，並將此兩培養基置於30℃培養箱中培養一 到兩天，以完成第二個世代的複印。觀察第一世代和第二世代複印中的可篩 選用之培養基其菌落的生存情形，並篩選出在第一世代和第二世代複印中皆 能生存下來的菌株，此些菌株的基因型態是穩定存在的，也較有可能是所要 的轉形白色念珠菌菌株，以此將近一步的運用酵母菌菌落聚合酶連鎖反應或 是南方點墨法(Southern blotting)，來分析複印所篩選出的菌株之基因型態是否
為本研究中所要的(第一世代和第二世代複印中的 YPD 固態培養基，可作為 簡易與暫時性的菌落保存，以及提供後續分析基因型態的正確性所用)。
3.2.4 酵母菌菌落聚合酶連鎖反應(Yeast Colony PCR)
醋酸鋰酵母菌轉形實驗所長出的菌落，經過初步的兩個世代之複印篩 選，所得到基因型態穩定的菌株，將近一步運用酵母菌菌落聚合酶連鎖反應 來驗證是否為所要的轉形菌株。利用200 μl 的微量吸管刮取適量的菌落於 30 μl 的 0.08% NaOH 中(其加入的菌量足以讓澄清的液體變為白色的混濁即 可)，混合均勻後，以 95℃十五分鐘加熱處理，使其細胞破裂，然後稍微快速 離心，讓細胞殘骸離下，接著將上清液(即 DNA 的所在)吸取至新的離心管中，
作為-20℃保存和酵母菌菌落聚合酶連鎖反應。由於 NaOH 會影響聚合酶連鎖 反應，所以在進行酵母菌聚合酶連鎖反應時，不宜加入太多經 NaOH 處理所 釋出的crude DNA，每 25 μl 的聚合酶連鎖反應，至多加入 2 μl 的 crude DNA，
以此方法來驗證轉形的白色念珠菌菌株是否為本研究所要的。