BWP17- - -Yeast form

Yeast form

TET

TET--CaCDC4CaCDC4--6HF6HF- -Hyphal form Hyphal form

0hr

0hr 6hr6hr

40μ40μg/ml Doxycyclineg/ml Doxycycline inductioninduction

30μm

30μm BWP17

BWP17- -Yeast form Yeast form

BWP17 BWP17- -Hyphal form Hyphal form

30μm

30μm

圖十七、同步誘導 TET-CaCDC4-6HF 菌株大量表現 CaCdc4-6HF 與酵母菌和真 性菌絲形態的形成。直接以含有 40 μg/ml doxycycline 的 YPD (pH 5.4~5.6)和 YPD+10% serum (pH 7.2)培養液，來處理經隔夜培養的 TET-CaCDC4-6HF 菌液六 個小時，以同步誘導菌株大量表現CaCdc4-6HF 重組蛋白質與酵母菌和真性菌絲 形態的形成。BWP17 作為對照組。

Input E R Input E R

BWP17 BWP17BWP17

NP40 NP40 lysislysis

buffer: ( buffer: (--)) Yeast form

Yeast form HyphalHyphalformform

Ca

anti--FLAGFLAG

WB: anti

WB: anti--FLAGFLAG kDakDa

圖十八、以西方點墨法分析同時誘導 CaCdc4-6HF 的表現與酵母菌和真性菌絲 形態形成之 TET-CaCDC4-6HF 菌株並經過單一次親合力純化法的純化產物。將 cell lysates 從已經過 doxycycline 與生長形態誘導的 TET-CaCDC4-6HF 菌株中抽 取出來，再利用anti-FLAG-M2 affinity gel 進行純化，以含有 150 mM 和 300 mM NaCl 的 1x TBS 各清洗三次與兩次，每次十五分鐘，然後再以 150 ng/μl 3x FLAG peptides 進行 elution，最後將純化過程中的 input、elute/E 和 resin/R 部分，以西 方點墨法進行分析，而銀染的分析於P.117 圖二十六 A 和 P.120 圖二十七 A。以 BWP17 和 NP40 lysis buffer 進行純化的產物，作為對照組；＊表示非專ㄧ性的 bands；箭頭則表示所要觀察的位置。

((--): Input

Input ElutionElution ResinResin

Ca CaCdc4Cdc4- -WD40 WD40--6HF6HF

CaCdc4CaCdc4- -F box F box--6HF6HF WB: anti WB: anti--FLAGFLAG IP: anti

IP: anti--FLAGFLAG Yeast form

Input ElutionElution ResinResin

IP: anti IP: anti--FLAGFLAG Hyphal

Hyphalformform

170 CaCdc4Cdc4- -WD40-WD40-6HF6HF

Ca CaCdc4Cdc4- -F box F box--6HF6HF WB: anti WB: anti--FLAGFLAG

＊＊

＊

＊

圖十九、以西方點墨法分析已先誘導成酵母菌和真性菌絲形態形成後再誘導 6xHis-FLAG tagged 重 組 蛋 白 質 表 現 之 TET-CaCDC4-F box-6HF 和 TET- CaCDC4-WD40-6HF 菌株並經過單一次親合力純化法的純化產物。將 cell lysates

從經過 doxycycline 與生長形態誘導的 TET-CaCDC4-F box-6HF (F 表示)與 TET-CaCDC4-WD 40-6HF (W 表示)菌株中抽取出來，再利用 anti-FLAG-M2 affinity gel 進行純化，並將純化過程中的 input、elution 和 resin 部分，以西方點 墨法進行分析，而銀染的分析於P.117 圖二十六 B 和 P.120 圖二十七 B。以 BWP17 (B)和 NP40 lysis buffer (-)進行純化的產物，作為對照組；＊表示非專ㄧ性的 bands；箭頭則表示所要觀察的位置。

B

A

CaCdc4-WD40-6HF 所找到的相關性蛋白質，會有共同與差異性的 patterns；但在 resin 的部份(見 P.120 圖二十七)，各個 6xHis-FLAG-tagged 重組蛋白質所找到的 CaCdc4 相關性蛋白質之分子量 patterns 較沒有明顯的差異存在。而將於最後的 結果整理中，進一步地把這次研究中的所有銀染結果圖，做ㄧ個綜觀性的分析與 總整理。

7. 建構以大腸桿菌 BL21 大量表現 6xHis-Tagged CaCdc4 重組蛋 白質之 pET-29b(+)-CaCDC4 菌株

在這次以大腸桿菌 BL21 大量表現 CaCdc4-6xHis 重組蛋白質的菌株建構 中 ， 是 以 pET-29b(+) 載 體 (Novagen) 和 CaCDC4 open reading frame (ORF) (CaCDC4 的 ORF 序 列 是 由 Candida Genome Database 而 來 ) 進 行 pET-29b(+)-CaCDC4 質體的製備。接著，再將此質體轉形至大腸桿菌 BL21 中，

並且由於pET-29b(+)載體上含有 lacI 的轉譯序列和 pET-29b(+) cloning/expression 區域，而 pET-29b(+) cloning/expression 區域內含有 lac 操作子(lac operator)，

Multiple Cloning Sites (MCS)，以及 S‧Tag 和 His‧Tag 的轉譯序列(見 P.37 附圖 十三)；所以可以藉由 IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)來大量誘導 6xHis-tagged CaCdc4 重組蛋白質的表現。

首先將 CaCDC4 ORF 從已製備且經定序確認好的 pCR2.1-TOPO-CaCDC4 質 體，利用XhoI 限制酶將此 CaCDC4 片段置入 pET-29b(+)載體上的 MCS 之 XhoI 限制酶切點內，以製備出 pET-29b(+)-CaCDC4 質體。然後再利用限制酶反應來 確認所製備出的 pET-29b(+)-CaCDC4 質體是正確的：當利用 XhoI 限制酶反應 時，編號(7)-5 和(7)-W3 的 pET-29b(+)-CaCDC4 有釋出 CaCDC4 片段大小的 band (2,307 bp) (data not shown)； 且 由 於 是 利 用 相 同 的 XhoI 限 制 酶 切 點 進 行 pET-29b(+)-CaCDC4 質體的建構，所以將會運用 pET-29b(+)載體上的 EcoR1 與 位於CaCDC4 之第 1648 bp 位置上的 EcoR1 限制酶切點來確定 CaCDC4 的方向

性，以此確定出編號(7)-5 和(7)-W3 的 CaCDC4 在 pET-29b(+)-CaCDC4 質體上為 正確的方向性(data not shown)；最後再以 DNA 定序來確認此 pET-29b(+)-CaCDC4 質體是正確無誤的。然後，將此製備好的 pET-29b(+)-CaCDC4 質體進行大腸桿 菌BL21 的轉形實驗，以得到可以運用 IPTG 來大量誘導 6xHis-tagged CaCdc4 重 組蛋白質之表現的pET-29b(+)-CaCDC4 大腸桿菌菌株。

8. 建立最佳誘導攜帶 pET-29b(+)-CaCDC4 質體之大腸桿菌菌株 BL21 表現 CaCdc4-6xHis 重組蛋白質之條件

pET-29b(+)-CaCDC4 菌株建構好之後，接下來將會以各種不同的環境情況 下，來測試出CaCdc4-6xHis 最佳的誘導表現條件。將 pET-29b(+)-CaCDC4 菌株 以0.5 mM IPTG 分別於 25℃、30℃和 37℃的溫度下，以及 3、4、5、6、8，16.5 小時的處理時間，來誘導 CaCdc4-6xHis 重組蛋白質的表現，接著於不同的時間 點將菌體收集後，直接以1x SDS sample buffer 處理，並進行 SDS-PAGE、coomassie blue staining 和西方點墨法分析，並希望藉由 coomassie blue 與西方點墨法的分 析，以找出最佳誘導 CaCdc4-6xHis 大量表現之條件：由圖二十可以觀察到，在 25℃下的每一個誘導時間點，CaCdc4-6xHis bands 的深度皆較沒有加入 IPTG 誘 導之對照組的深度有明顯地增加；但是CaCdc4-6xHis 在 30℃和 37℃下的每一個 誘導時間點之bands 的深度，和沒有加入 IPTG 誘導之對照組的深度相比，卻反 而有降低的情形。而也利用西方點墨法分析來觀察CaCdc4-6xHis 於 25℃下的每 一個誘導時間點之表現量的情形，發現以三個小時的誘導時間，CaCdc4-6xHis 就有很好的表現量(圖二十ㄧ)。所以在運用大腸桿菌 BL21 的系統來大量誘導 6xHis-tagged CaCdc4 重組蛋白質之表現的策略上，之後是以 0.5 mM IPTG、於 25℃下，處理 pET-29b(+)-CaCDC4 大腸桿菌菌株三個小時的條件，來大量誘導 CaCdc4-6xHis 的表現。

接下來，想要更進一步地確認，當以 0.5 mM IPTG、於 25℃下，處理

0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5

Coomassie blue staining 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5

Coomassie blue staining

圖二十、建立最佳誘導攜帶 pET-29b(+)-CaCDC4 質體之大腸桿菌菌株 BL21 表現 CaCdc4-6xHis 重組蛋白質之條件。將帶有 pET-29b(+)-CaCDC4 質體之大腸桿菌菌株，以 0.5 mM IPTG 分別於 25℃、30℃和 37℃的溫度，以及 3、4、5、6、8 和 16.5 小時的 處理，來誘導CaCdc4-6xHis 重組蛋白質的表現，接著將菌體收集後，直接以 1x SDS sample buffer 處理，並進行 SDS-PAGE 和 coomassie blue staining。0 表示沒有經過 IPTG 處理，.5 則是以 0.5 mM IPTG 處理；(-)表示以零個小時處理，以作為負對照組；箭頭則表示所 要觀察的位置。

130 100 72 55 40 33

24 17 kDa

0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5 0 .5

3hr 3hr 4hr 4hr 5hr 5hr 6hr 6hr 8hr 8hr 16.5hr 16.5hr 0hr 0hr

CaCdc4

-6xHis

＊