附圖十三
3.1.1.2 嵌入 DNA (Insert DNA)的製備
嵌入 DNA 的來源通常有兩種，一種是所需的片段已保存或位在其他的 載體上，直接藉由限制酶反應和膠體回收的純化，即可得到所要的嵌入DNA 片段；另一種則是利用設計兩端帶有特定之限制酶切點的引子(primers)，和 Pfu DNA 聚合酶連鎖反應，將所要的嵌入 DNA 片段自白色念珠菌 genomic
DNA 或是某些特定的載體中夾出，並將此 DNA 片段利用 TA 選殖，將其保 存在 pCR2.1-TOPO (invitrogenTM)載體上，再以限制酶反應和膠體回收，得 到所要的嵌入DNA 片段。
另外，利用設計兩端帶有特定基因的短序列互換區域(short-flanking homology/SFH Regions)的引子，和 Pfu DNA 聚合酶連鎖反應，所製備出的 DNA 片段，也將會利用 pCR2.1-TOPO (invitrogenTM)載體作為保存，但此 DNA 片段將不進行後續的接合反應和轉形實驗，而是直接進行醋酸鋰酵母 菌轉形實驗。並利用SFH 區域，將此 DNA 片段嵌入白色念珠菌的基因體中。
3.1.1.2.1 Pfu 聚合酶連鎖反應(Pfu PCR)
Pfu DNA 聚合酶(Pfu DNA polymerase)具有 3’端向 5’端之外切酵素活 性(3’ to 5’ exonuclease activity)，能校正 DNA 在 PCR 過程中所產生的錯 誤。由於傳統的Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、Tth DNA 聚合酶 (Tth DNA polymerase)，及其相關的產品如 AmpilTaq、KlenTaq 等，都不具 有校正功能(proof reading)，且 Vent、Deep Vent、Tli、Pwo、UlTma 等 DNA 聚合酶，雖然具有校正的功能，但其校正的能力並沒有Pfu DNA 聚合酶來 得好；即Pfu DNA 聚合酶之錯誤率比 Taq DNA 聚合酶及其相關產品低 10 倍，比Vent 和 Pwo 低 2~4 倍，比 UlTma 低 30 倍(MDBio, Inc.)；所以本實 驗中，將會使用Pfu DNA 聚合酶(MDBio, Inc.)來製備嵌入 DNA。此外，
因為Pfu DNA 聚合酶具有 3’端向 5’端之外切酵素活性，可能會將聚合酶 連鎖反應中的引子給分解掉，特別是在沒有dNTP 之溶液的情況下；因此，
Pfu DNA 聚合酶必須最後再加入反應液中，並於加入後立即進行聚合酶連 鎖反應。另外，Pfu 聚合酶連鎖反應所產生的 DNA 片段為平端(blunt end)，
不像Taq DNA 聚合酶會有 3’端的 A 鹼基突出，所以 Pfu 聚合酶連鎖反應 所產生的DNA 片段不能直接進行 TA 選殖，必須經過 PCR 產物之 3’端的
加A 鹼基作用(A-tailing)後，方可進行 TA 選殖。
首先設計一對適當的引子(可利用 MacVectorTM 7.2 軟體來進行預測和 設計)，其兩端可帶有特定的限制酶切點，或是兩端帶有特定基因的短序列 互換區域(short-flanking homology/SFH Regions)等。並進行 50 μl 的 Pfu 聚 合酶連鎖反應[約 10~100 ng 的 DNA template＋5 μl 的 10 x Pfu PCR buffer
＋5 μl 的 2 mM dNTP＋0.1~0.5 μM primers＋2.5 units 的 Pfu DNA polymerase，補二次水至 50 μl]，將欲研究的基因片段於白色念珠菌之 genomic DNA 夾出，或是將某些特定的 DNA 片段於載體中夾出。待 Pfu 聚合酶連鎖反應完後，再利用Gel-MTM Gel Extraction System (VIOGENE) 將 DNA 片段純化，並約以 30 μl 的二次水進行回溶，接著將此純化後的 DNA 片段進行 PCR 產物之 3’端的加 A 鹼基作用。
3.1.1.2.2 PCR 產物之 3’端的加 A 鹼基作用(A-Tailing)
將上述經過 Pfu 聚合酶連鎖反應[其引子兩端帶有特定的限制酶切 點 ， 或 是 兩 端 帶 有 特 定 基 因 的 短 序 列 互 換 區 域 (short-flanking homology/SFH Regions)等]，以及純化過後所產生的 DNA 片段(約 30 μl)，
進行3’端的加 A 鹼基作用。取 5 μl 的 10 x Taq PCR buffer，1 μl 的 10 mM dATP (最終的反應濃度需為 0.2 mM)，以及 2.5 units 的 Taq DNA 聚合酶 (MDBio, Inc.)，加入上述 Pfu 聚合酶連鎖反應之產物(約 30 μl)，並補水至 50 μl，混合均勻後，置於 72℃中作用 10~15 分鐘。待 3’端的加 A 鹼基作 用完畢後，再利用PCR-MTM Clean Up System (VIOGENE)將 DNA 片段純 化，並約以30 μl 的二次水進行回溶即可。
3.1.1.2.3 TA 選殖(TA Cloning)
本實驗是利用TOPO TA Cloning Kit (invitrogenTM)來進行 TA 選殖。首
先將上述經Pfu 聚合酶連鎖反應和 3’端的加 A 鹼基作用處理後的 DNA 片 段，取0.5~4 μl 出來，加入 1 μl 的 salt solution，1 μl 的 pCR2.1-TOPO vector (由於此載體與 topoisomerase I 為共價鍵結，以形成 activated vector，所以 在取用和保存上要小心，以免topoisomerase I 失去活性，而降低了 TA 選 殖的效率。且由於此 TOPO cloning 反應是藉由載體上的 topoisomerase I 來進行的，所以整個 TOPO cloning 反應中，不需加入接合酵素。另外，
TOPO 載體的溶液顏色會呈現黃色至淡紅色，此為正常的現象)，並補水 至6 μl，混合均勻後，置於室溫中進行 TOPO cloning 反應三十分鐘。待三 十分鐘後，取2 μl 的 TOPO cloning 反應液，加於一管的 one shot chemically competent E. coli (invitogenTM)中，切記此過程中，不要混合樣本，以進行 轉形作用，並置於冰上三十分鐘。三十分鐘後，將其置於42℃中熱休克三 十秒，此過程中不需要搖晃樣本，緊接著再換置於冰上，並加入250 μl 的 SOC 培養液，於 37℃中培養一個小時，使細胞恢復[由於 one shot chemically competent E. coli (invitogenTM)較昂貴，所以可以使用自製的勝任細胞，以 進行轉形，詳見材料與方法 3.1.3 轉形(Transformation)]。接下來，直接取 少部份的菌液(約 50 μl~200 μl)，利用過火並且冷卻過的玻璃棒，或是滅過 菌的玻璃珠，將菌液均勻地塗在含有適用的抗生素，以及40 μl 的 40 mg/ml X-Gal 之 LB 固態培養基上(含有適用的抗生素之 LB 固態培養基，需先自 4℃中拿出，並置於 37 ℃培養箱中回溫約一個小時，待回溫後，再取 40 μl 的40 mg/ml X-Gal 均勻地塗抹在培養基上，再置回 37℃培養箱中，讓培 養基充分地吸收 X-Gal 至少十五分鐘)，並於 37℃培養箱中，進行藍白篩 選至隔天。隔日，將所長出的白色菌落，以大腸桿菌菌落聚合酶連鎖反應，
或是限制酶反應，以及定序分析[詳見材料與方法 3.1.4 大腸桿菌菌落聚合 酶連鎖反應 (E. coli Colony PCR)，3.1.5 限制酶反應確認，以及 3.1.6 核酸 定序 (DNA sequencing)]，來進一步確認篩選出的菌株是否含有所要的質 體(其上含有所要的嵌入 DNA 片段)。待確定後，可將菌株做-80℃的保存
(每 800 μl 菌液＋200 μl 100% glycerol)，以方便後續嵌入 DNA 的準備和轉 形作用，或是將含有SFH 區域的 DNA 片段直接進行醋酸鋰酵母菌轉形實 驗。
3.1.1.2.4 限制酶反應
嵌入DNA 片段經由 pCR2.1-TOPO 載體保存並確認無誤後，將會使用 合適的限制酶切下，再用Gel-MTM Gel Extraction System (VIOGENE)進行 純化，以繼續後續的接合反應和轉形作用(其限制酶反應之步驟，詳見於 3.1.1.1 載體的製備之 3.1.1.1.1 限制酶反應)，或是直接進行醋酸鋰酵母菌轉 形實驗(其限制酶反應步驟，詳見於 3.2.1 將進行醋酸鋰酵母菌轉形實驗的 DNA 片段之準備)。