大黃酸（Rhein）對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞之凋亡路徑探討

一、利用流式細胞儀檢測大黃酸對人類子宮頸癌細胞粒線體膜電位（∆Ψm）之影響

粒線體功能不良（Mitochondrial dysfunctions）包括粒線體膜電位（ΔΨm）

的降低、穿透性的轉變（permeability transition）以及 cytochrome

c

由粒線體中釋 出到細胞質中，而誘導細胞凋亡的產生，皆是與細胞凋亡（apoptosis）有關（Xia

et al.

, 1999）。故本實驗是以流式細胞儀檢測染有 DiOC6之Ca Ski 細胞，若粒腺體膜 電位降低，則DiOC6染劑就會結合較少，由此來檢測粒線體膜電位是否會因大黃酸 的處理後有降低的現象，進而誘導細胞凋亡作用的發生。

由實驗結果發現（圖4-17），當以大黃酸 rhein 50 µM 處理子宮頸癌 Ca Ski 細 胞1 小時後，即可明顯使 Ca Ski 細胞之粒線體膜電位下降（左移），隨著時間的增 加，粒線體膜電位仍有持續緩慢降低的趨勢。顯示大黃酸rhein 會使子宮頸癌 Ca Ski 細胞損傷而導致粒線體膜電位的降低（Mitochondria depolarization），進而誘導細 胞凋亡的發生。

Time (h)

0 1 3 6 12 24

Mitochondria membrane potential (%)

75 80 85 90 95 100 105

* *

*

*

*

圖4-17 50 µM 大黃酸對 Ca Ski 細胞之粒腺體膜電位（∆Ψm）之影響

Figure 4-17. Effect of rhein on mitochondria membrane potential（∆Ψm）of Ca Ski cells treated with 50 µM of rhein for 1~24 hours.

Control 1h 3h

6h 12h 24h

50 µM Rhein

Control 組

A.

B.

二、利用流式細胞儀檢測大黃酸對人類子宮頸癌細胞活性氧化物（reactive oxygen species；ROS）產生之影響

近來研究顯示，活性氧化物（reactive oxygen species；ROS）在誘導細胞凋亡 當中扮演一個重要的角色（Jung et a

l

., 2001）。粒線體是ROS產生的主要位置而這 又和細胞的死亡有關（Fleury

et al

., 2002）。粒線體中ROS的大量產生（ROS burst）

會造成粒線體的功能不良（mitochondrial dysfunction）。由前述結果顯示，粒線體 膜電位（∆Ψm）在大黃酸處理後短時間內即下降，為了檢測大黃酸誘導之細胞凋亡 是否和ROS的產生有關，在此利用流式細胞儀分析細胞中ROS的產生。

結果顯示（圖4-18），以大黃酸rhein 50 µM處理子宮頸癌Ca Ski細胞0.5小時後 即有明顯ROS大量產生（ROS bust）之現象發生（peak右移），隨後1小時後即慢慢 降低，有可能是因細胞抗氧化酵素將ROS所清除，所以之後ROS產生有降低的趨勢，

這仍須做進一步的確認。但由此結果可得知，在粒線體膜電位（∆Ψm）結果上發現，

在1小時即有膜電位下降的現象（圖4-17）可能是因為ROS在0.5小時即產生所造成 的粒線體膜電位（∆Ψm）之下降結果，而後造成膜電位持續下降之原因有可能其他 因素所造成。仍需做更進一步檢測才能得知。

ROS

Time (h)

0 0.5 1 2 4 6

ROS products (% cells)

0

Figure 4-18. Effect of rhein on ROS products of Ca Ski cells treated with 50 µM of rhein for 0.5~6 hours.

Control

三、利用流式細胞儀檢測大黃酸對人類子宮頸癌細胞之鈣離子釋出

已知內質網中鈣離子釋出會造成粒線體膜電位（∆Ψm）之下降，前述結果得知 粒線體膜電位在短時間1 小時內即有下降之現象發生，為探討先前發現之粒線體膜 電位在短時間即下降之原因，在此以Indo-1-AM 會特異性的和鈣離子結合之特性，

利用流式細胞儀分析鈣離子的釋出，Indo-1 會與鈣離子特異性結合，螯合鈣離子之 螢光染劑會有光學特性上的改變，在（紫外光）UV 的激發下，Indo-1 放出光

（emission）的強度會隨著細胞內鈣離子濃度的改變，而發散出不同強度的螢光，

故可用比例法測得或直接測得的螢光強度得到鈣離子濃度的相對值，實際濃度需經 校對後獲得。

本實驗以 50 µM 大黃酸處理 Ca Ski 細胞，經 0~24 小時後收集細胞，加入 Indo-1-AM 反應，以探討大黃酸是否誘導內質網中鈣離子釋出。實驗結果顯示（圖 4-19），以大黃酸處理之人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞 0.5 小時後，即可發現鈣離子釋 出增加，可由量化圖看出，隨著處理時間的增加，到2 小時鈣離子釋出到最大量，

隨後即降低至平衡，由此可推測，大黃酸可誘導人類子宮頸癌Ca Ski 細胞，在短時 間內造成鈣離子之釋出，而去影響粒線體膜電位之下降，進而促使細胞凋亡發生。

Time (h)

0 0.5 1 2 3 4 6 24

Calcium release (%cell)

-80 -60 -40 -20 0 20 40

* *

圖4-19. 大黃酸 rhein 對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞之鈣離子釋出之影響

Figure 4-19. Effect of rhein on calcium release of Ca Ski cells treated with 50 µM of rhein for 0.5~24 hours.

Control 0.5h

2h

1h

4h

24h 3h

6h

50 µM Rhein Control 組

四、利用流式細胞儀檢測大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞凋亡相關蛋白質 caspase-3

由前述實驗結果顯示，以大黃酸rhein 處理 Ca Ski 細胞，會造成細胞週期的停 滯，並誘導Ca Ski 細胞走向細胞凋亡途徑。Caspase-3 為 Cysteine protease family 之一員，是參與細胞凋亡之主要作用蛋白。Caspase-3 的活化會促使 PARP（poly

（ADP-ribose）polymerase）分解，進而造成 DNA fagmentation 之產生，造成細胞 凋亡之現象。

本實驗利用 PhiPhiLux-G1D1 kit（OncoImmunin, Inc., Maryland, USA）檢測 casapse-3 之活性。以 50 µM 濃度之大黃酸投予 Ca Ski 細胞經 6、12、24、48 及 72 小後收集細胞，加入 PhiPhiLux-G1D1 kit 中之基質反應，以探討大黃酸是否誘導 caspase-3 活性產生。實驗結果顯示（圖 4-20），以大黃酸處理之人類子宮頸癌Ca Ski 細胞6 小時後，即可明顯發現 caspae-3 活性明顯增加，可由量化圖明顯看出，隨著 處理時間的增加到 12 小時而有上升的情形出現，由此可知，大黃酸可誘導人類子 宮頸癌Ca Ski 細胞之 caspase-3 活性增加，進而促使細胞凋亡發生。

Caspase-3 activity

Time (h)

c 6h 12h 24h 48h 72h

Caspase-3 activity (% cells)

0 10 20 30 40 50

*

*

* * *

圖4-20. 大黃酸 rhein 對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞 caspase-3 活性之影響 Figure.4-20. Effect of rhein on caspase-3 activity of Ca Ski cells treated with 50 M of rhein for 0~72 hours.

Control 6h 12h

24h 48h 72h

50 µM Rhein Control 組

五、以鈣離子拮抗劑（BAPTA）評估大黃酸對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞之粒線體 膜電位（∆Ψm）之影響

由先前實驗得知，鈣離子於大黃酸處理人類子宮頸癌Ca Ski 細胞株 0.5~2 小時 當中釋出，為證明是否鈣離子是影響粒線體膜電位（∆Ψm）於短時間即下降的原因，

因此，在此我們利用鈣離子拮抗劑BAPTA 來螯合鈣離子，並檢測大黃酸是否能夠同 樣在先前短時間內即有粒線體膜電位下降之現象。以BAPTA 於加藥前 3 小時加入細 胞中反應，之後再以大黃酸處理人類子宮頸癌Ca Ski 細胞經 2 小時後收取細胞，加 入DiOC6，以流式細胞儀檢測粒線體膜電位之變化。結果顯示，人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞以rhein 處理後兩小時，即有明顯粒線體膜電位下降之現象（圖 4-21A），而在 以BAPTA 鈣離子螯合劑先處理後再加入 rhein 之粒線體膜電位卻又恢復制與控制組 相同情況（圖4-21C），並且我們可由圖 4-22B 明顯看出加了 BAPTA 之大黃酸處理 組明顯比大黃酸處理組右移，且與控制組之粒線體膜電位非常接近，表示粒線體膜 電位在鈣離子被螯合的情況下，大黃酸並未能使粒線體膜電位在短時間內（2 h）下 降，且與控制組之粒線體膜電位非常接近。

圖4-21. 利用鈣離子拮抗劑（BAPTA）螯合鈣離子來評估 rhein 所誘導之粒線體 膜電位之改變

Figure 4-21. Effect of calcium antagonist BAPTA on rhein in Ca Ski cells.（A）

Control and 50 µM rhein（B）50 µM rhein and BAPTA+ 50 µM rhein（C）Control and BAPTA+ 50 µM rhein（D）Relative changes in mitochondria membranes potential

A. B. C.

Control BAPTA Rhein BAPTA+Rhein

Mitochrondria membrane potential (% cells)

0

六、以鈣離子拮抗劑（BAPTA）評估大黃酸對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞之鈣離子 釋出之影響

由先前實驗得知，鈣離子於大黃酸處理人類子宮頸癌Ca Ski 細胞株 0.5~2 小時 當中釋出，因此，在此我們利用鈣離子拮抗劑BAPTA 來螯合鈣離子，並檢測大黃酸 是否能夠同樣在先前短時間內即有鈣離子釋出之現象。以BAPTA 於加藥前 3 小時加 入細胞中反應，之後再以大黃酸處理人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞經 2 小時後收取細 胞，加入Indol-1-AM，以流式細胞儀檢測鈣離子釋出之變化。結果顯示，人類子宮 頸癌Ca Ski 細胞以 rhein 處理後兩小時，即有明顯鈣離子釋出之現象（圖 4-22A），

在加了 BAPTA 鈣離子螯合劑後其 rhein 造成鈣離子釋出作用明顯由 5%降至 1.5%

（圖4-22D），並且我們可由圖 4-22C 明顯看出加了 BAPTA 之大黃酸處理組明顯比 大黃酸處理組左移，表示以BAPTA 處理後有成功的將鈣離子阻斷，而證明粒線體膜 電位（∆Ψm）在短時間內（2 h）下降，是與鈣離子的釋出有相關。

圖4-22. 利用鈣離子拮抗劑（BAPTA）螯合鈣離子來評估 rhein 所誘導之鈣離子 釋放之改變

Figure 4-22. Effect of calcium antagonist BAPTA on rhein in Ca Ski cells. （A）

Control and 50 µM rhein （B）Control and BAPTA+ 50 µM rhein（C）50 µM rhein and BAPTA+ 50 µM rhein（D）Relative changes in calcium release.

A. B. C.

Control BAPTA Rhein BAPTA+Rhein

Calcium release (%)

0

第七節 利用西方點墨法探討大黃酸對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞週期停滯之

在文檔中 大黃酸誘導人類子宮頸癌細胞Ca Ski細胞週期停滯及細胞凋亡作用之探討; Rhein Induced Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Cervical Epidermoid Carcinoma Ca Ski Cell Line (頁 84-96)