第三章 實驗材料及方法
第七節 利用西方點墨法探討大黃酸對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞週期停滯之 相關蛋白質表現
由先前實驗發現，大黃酸處理Ca Ski 細胞後，使細胞週期停滯於 G0/G1期，有 可能是大黃酸調控了與G1 phase 相關分子的表現，所以本實驗利用西方點墨法探討 G1期相關蛋白質表現。
本實驗將大黃酸rhein（50 µM）與 Ca Ski 細胞共同培養，於不同時間（0、6、
12、24 及 48 小時）收集細胞，萃取其總蛋白質，再利用 Western blotting 方法檢 測細胞週期G0/G1期相關蛋白質cyclin D3/Cdk4、Cdk6、Cyclin E/Cdk2、p53、p21 及p27 蛋白表現量變化。
一、細胞週期中調控G0/G1期相關蛋白質表現
細胞週期的進行當中，調控細胞週期的進行的重要因子就是 Cyclin 與 Cdks
（cyclin dependent kinases），而參與G1期的調控分子當中，在G1中期是Cyclin D1、 D2、D3與Cdk4、Cdk6，參與 G1晚期的調控分子是Cyclin E 與 Cdk2。
經不同時間大黃酸的處理，隨著處理時間的增加，Cdc25A、Cdk4 與 Cdk6 蛋白 表現量與控制組比較有逐漸降低現象。此外，Cyclin D3於6、12 小時表現量有下降 的情形，而在24 小時有上升表現，48 小時表現量有降低的表現。Cyclin E 與 Cdk2 的蛋白表現量也有隨著時間的增加而有降低現象發生。其結果導致細胞週期停滯在 G0/G1期。
二、Cyclin-dependent kinase inhibitor（CDKI）蛋白質表現
細胞週期中另一群重要的調控因子，就是 CdkI（cyclin dependent kinase inhibitors），本實驗亦探討抑制細胞週期進行的 CdkI 分子表現，包括有 p53、p21、
p27。p53 是種轉錄因子（transcription factor），當細胞 DNA damage 時，會活化
p53，其會造成細胞週期的停滯，使 DNA 進行修復，若遇到無法彌補的錯誤時，就 會使細胞進行細胞凋亡等生理反應，CdkI 中的 p21、p27 為 p53 主要下游調控分子，
p53 的活化會轉錄活化 p21 及 p27 使於細胞內的表現量上升而導致細胞週期停滯。
結果顯示，p53 蛋白表現量隨著時間的增加而有增加的現象，p21 及 p27 也有相同 的表現。綜合上述結果，rhein 會誘導 p53 增加而活化 p21 及 p27 蛋白量表現，進 而抑制了Cdc25A、Cdk4、Cdk6 與 Cyclin E/Cdk2 的蛋白表現量，而使細胞週期停 滯於G0/G1期。
圖4-23. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Cdk4 蛋白 之相對表現量
Figure 4-23. Western blotting analysis of Cdk4 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Cdk4 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Cdk4 level.
Cdk4
Time (h)
0 6 12 24 48
Cdk4 /β-actin
0 1 2
Cdk4
50 µM of rhein
C 6 12 24 48 （h）
β-actin A.
B.
圖4-24. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Cdk6 蛋白 之相對表現量
Figure 4-24. Western blotting analysis of Cdk6 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Cdk6 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Cdk6 level.
cdk6
Time (h)
0 6 12 24 48
Cdk6 /β-actin
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Cdk6
β-actin
C 6 12 24 48 （h）
50 µM of rhein A.
B.
圖4-25. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Cyclin D3
蛋白之相對表現量
Figure 4-25. Western blotting analysis of Cyclin D3 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Cyclin D3 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Cyclin D3 level.
β-actin
50 µM of
C 6 12 24 48 （h）
Cyclin D3
Cyclin D3
Time (h)
0 6 12 24 48
Cyclin D3/β-actin
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
A.
B.
圖4-26. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Cyclin E Figure 4-26. Western blotting analysis of Cyclin E expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Cyclin E in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Cyclin E level.
50 µM of
C 6 12 24 48 （h）
β-actin Cyclin E
Cyclin E
Time (h)
0 6 12 24 48
Cyclin E/β-actin
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
A.
B.
圖4-27. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Cdk2 Figure 4-27. Western blotting analysis of Cdk2 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Cdk2 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Cdk2 level.
50 µM of
C 6 12 24 48 （h）
β-actin Cdk2
Cdk-2
Time (h)
0 6 12 24 48
Cdk2/β-actin
0 1 2
A.
B.
圖4-28. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 p53 蛋白 之相對表現量
Figure 4-28. Western blotting analysis of p53 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in p53 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in p53 level.
β-actin
50 µM of rhein
C 6 12 24 48 (h)
p53
Time (h)
0 6 12 24 48
p53/β-actin
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
p53 A.
B.
圖4-29. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 p21 蛋白 之相對表現量
Figure 4-29. Western blotting analysis of p21 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in p21 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in p21 level.
p21
Time (h)
0 6 12 24 48
p21CIP1 /β-actin
0 1 2
p21
β-actin
C 6 12 24 48 （h）
50 µM of rhein A.
B.
圖4-30. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 p27 蛋白 之相對表現量
Figure 4-30. Western blotting analysis of p27 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in p27 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in p27 level.
p27
β-actin
50 µM of rhein
C 6 12 24 48 （h）
p27KIP
Time (h)
0 6 12 24 48
p27KIP /β-actin
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
A.
B.