大黃酸（rhein）誘導人類子宮頸癌細胞株（Ca Ski）細胞凋亡之探 討

一、利用DAPI 染色檢測凋亡細胞

DAPI（4 -6-diamidine-2-phenyl indole）是種核酸螢光染劑，其會專一性的 binding 在 DNA 雙股螺旋之小溝（minor groove）上，當細胞凋亡時會出現染色質 凝結（chromosomes condensation ）、DNA 斷裂（DNA fragmentation）情形發生，

若細胞凋亡越嚴重，則DNA 斷裂越多而 DAPI 染劑就會染上越多，在螢光顯微鏡下 可觀察到白色螢光強度就越亮。

人類子宮頸癌Ca Ski 細胞以不同濃度（0、5、10、25、50、100 µM）之大黃 酸rhein 處理 12 和 24 小時後，收集細胞以 DAPI 染劑將細胞染色，利用位像差顯 微鏡，觀察螢光強度。我們更進一步檢視細胞死亡是否是經由細胞凋亡路徑，我們 由DAPI staining assay，將 DNA 雙股螺旋小溝（minor groove）上接上 DAPI 螢光，

在螢光顯微鏡下觀察，與對照組比較，大黃酸處理組螢光明顯增加，由圖 4-12 於 12 小時大黃酸 rhein 給予下，隨著的濃度增加可發現螢光強度有增加的現象，白色 螢光明顯比控制組亮；於24 小時大黃酸給予下（圖 4-13），可以看到隨著濃度的增 加有明顯白色螢光增強的趨勢出現，可明顯看出凋亡小體（apoptotic body）的細 胞出現。顯示大黃酸rhein 會造成人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞 DNA fragmentation 而 造成凋亡。

圖4-12. 不同濃度之大黃酸處理 Ca Ski 細胞 12 小時後 DAPI 染色觀察

Figure 4-12. Characterization of rhein induce cell death in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 12 hours, and they were harvested and were stained with DAPI.

Control 5 µM

10 µM 25 µM

50 µM 100 µM

圖4-13. 不同濃度之大黃酸處理 Ca Ski 細胞 24 小時後 DAPI 染色觀察

Figure 4-13. Characterization of rhein induce cell death in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 24 hours, and they were harvested and were stained with DAPI.

Control 5 µM

25 µM 10 µM

100 µM 50 µM

二、利用單細胞電泳分析（single cell gel electrophoresis assay）檢測 DNA 損傷細胞

單細胞電泳分析（single cell gel electrophoresis assay）就是所謂的彗星試驗

（Comet assay），可用來分析及定量DNA 損傷（DNA damage）程度，是一個簡單、

快速以及敏感度高的技術。利用DNA damage 後發生斷裂，藉由電泳將斷裂的 DNA 拖出膜外，形成彗星狀而命名之，由此可藉由拖尾的長短，觀察DNA 的損傷情形。

人類子宮頸癌Ca Ski 細胞以不同濃度（0、5、10、25、50、100 µM）之大黃 酸rhein 處理 12 和 24 小時後，藉由電泳將斷裂的 DNA 拖出膜外，以 DAPI 染劑將 細胞染色，利用位像差顯微鏡，觀察斷裂DNA 拖尾長度。我們更進一步檢視，細胞 是否受大黃酸 rhein 處理後 DNA 有受到傷害而造成斷裂情形發生，我們由 Comet assay，在螢光顯微鏡下觀察，對照組（Control）呈現完整圓形，DNA 沒有斷裂即 不會被電泳拖出膜外，大黃酸處理組可以明顯看出拖尾現象，由圖4-14 於 12 小時 大黃酸 rhein 投予下，隨著的濃度增加可發現拖尾現象越嚴重，控制組保持完整圓 形；於24 小時大黃酸投予下（圖 4-15），也可以看到隨著濃度的增加有嚴重拖尾出 現。顯示大黃酸rhein 會造成人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞 DNA damage 而造成 DNA fragmentation。

圖 4-14. 不同濃度大黃酸處理 Ca Ski 細胞 12 小時之 DNA 損傷分析—Comet assay

Figure 4-14. Characterization of rhein induce DNA damage in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 12 hours and they were harvested and were stained with DAPI.

Control

H2O2（Positive Control ）

5 µM

10 µM 25 µM

50 µM 100 µM

圖 4-15. 不同濃度大黃酸處理 Ca Ski 細胞 24 小時之 DNA 損傷分析—Comet assay

Figure 4-15. Characterization of rhein induce DNA damage in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 24 hours and they were harvested and were stained with DAPI.

H2O2（Positive Control ）

Control 5 µM

100 µM 25 µM

50 µM 10 µM

三、利用DNA 電泳法檢測大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞凋亡影響

當細胞進行細胞凋亡時，其DNA 常會裂解成 180-200 bp，若以 DNA 電泳跑 膠（agrose gel electrophoresis）後，再經 EtBr 染色，可以於電泳膠片上發現不連 續的DNA 裂解片段（DNA ladder pattern）。

由前述細胞存活實驗（圖4-1~5）及細胞週期分析（圖 4-6~10）之結果得知，

大黃酸可誘導 Ca Ski 細胞之細胞週期停滯或是發生細胞凋亡，又由 DAPI 試驗及 Comet assay 發現大黃酸具有使 Ca Ski 細胞 DNA 損傷發生，當細胞 DNA 受到傷害 時，細胞週期會停滯進行修復或者發生細胞凋亡作用。故本實驗將50 µM 之大黃酸 投予 Ca Ski 細胞，經抽取 DNA 後電泳分析，觀察其是否有 DNA 斷裂（DNA fragmentation）情形發生。

本實驗是以50 µM 濃度之大黃酸投予 Ca Ski 細胞經 24、48 及 72 小後收集細 胞，萃取DNA 進行電泳分析後，DNA 變化情形。可由圖 4-16 發現，於濃度 50 µM 之大黃酸投予下，經過48 和 72 小時後即有明顯的 DNA 斷裂（DNA fragmentation）

情形，其斷裂長度大約為180~200 bp 的倍率。由此電泳分析可得知，大黃酸會造 成Ca Ski 細胞 DNA 損傷而使細胞進行凋亡。

圖4-16 大黃酸誘導 Ca Ski 細胞之細胞凋亡— DNA 斷裂分析

Figure 4-16 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from Ca Ski cells treated with rhein. Lane 1, Maker; Lane 2, control; Lane 3, DNA from cells treated with 50 µM of rhein for 24h; lane 4, DNA from cells treated with 50 µM of rhein for 48h ; lane 5, DNA from cells treated with 50 µM of rhein for 72h.

700 bp

M C 24h 48h 72h 50 µM of Rhein

1000 bp

500 bp 900 bp

100 bp