利用西方點墨法探討大黃酸對人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞凋亡之相關 蛋白質探討

細胞進行凋亡有許多路徑，本研究中我們觀察到大黃酸 rhein 會誘導細胞粒線 體膜電位下降，因此本實驗以Western blotting 分析粒線體凋亡途徑相關蛋白表現。

此外，本實驗亦探討細胞膜死亡受體路徑相關蛋白質表現，以及細胞中NF-κB 之蛋 白表現，觀察其是否會是影響細胞凋亡之原因。

一、粒線體路徑相關蛋白質表現

由先前實驗得知，大黃酸可誘導人類子宮頸癌Ca Ski 細胞，粒線體膜電位的降 低而使細胞走向凋亡，為了更進一步探討粒線體凋亡途徑相關蛋白表現，本實驗將 大黃酸rhein（50 µM）與 Ca Ski 細胞共同培養，於不同時間（0、6、12、24 及 48 小時）收集細胞，萃取其總蛋白質，再利用Western blotting 方法檢測粒線體凋亡 途徑相關蛋白bcl-2、bax、cytochrome

c

、caspase-9 及 caspase-3 蛋白表現量變化。

結果顯示，bcl-2 family 中 pro-apoptoic protein—bax 蛋白表現在 6 及 12 小時有上 升，24 及 48 小時後 bax 表現量有減少情形（圖 4-31）。另外，Anti-apoptoic protein—bcl-2 蛋白表現，隨著大黃酸 rhein 處理的時間的增加，bcl-2 蛋白質表現 明顯降低，於48 小時幾乎完全消失（圖 4-32）。Cytochrome c 蛋白表現，於 6 小 時明顯出現至24 小時達最高量，48 小時有降低的現象（圖 4-33）。Caspase-9 蛋白 表現，可發現隨著時間的增加pro-caspasse-9 有降低的表現，且活化型態 caspase-9 於24 小時後蛋白表現逐漸增加（圖 4-34）。Caspase-3 蛋白表現（圖 4-35），可發 現在6、12 及 24 小時有活化型態的 caspase-3 出現。

二、細胞膜死亡受體凋亡路徑相關蛋白質表現

本實驗更進一步探討大黃酸 rhein 對細胞膜死亡受體路徑是否有影響，人類子

宮頸癌Ca Ski 細胞以 50 µM 大黃酸 rhein 處理，經 6、12、24 及 48 小時後分別收 取細胞，以Western blotting 分析 Fas 蛋白表現，隨著大黃酸處理的時間增加，Fas 蛋白表現明顯增加，表示大黃酸誘導人類子宮頸癌Ca Ski 細胞的凋亡路徑與 Fas 有 關（圖4-36）。有文獻指出，細胞膜死亡受體路徑當中 Fas 之活化會活化 caspase-8 及Bid 裂解成 tBid 而與 bcl-2 結合造成粒腺體膜電位的降低，因此我們更進一步檢 測 caspase-8 及 Bid 蛋白質表現。結果發現，（圖 4-37）pro-caspase-8 在 55 kDa 分子量位置有隨著大黃酸 rhein 處理時間的增加，而有蛋白表現量遞減的現象，且 active form caspase-8 在 46、26 kDa 蛋白表現量，有隨著時間的增加有遞增的表 現，表示 Fas 的活化會使 pro-caspase-8 裂解成具有活性型態的 caspase-8 進而直 接活化caspas-3 使細胞凋亡。另外，在 Bid 的蛋白表現上（圖 4-39），6 小時後可 發現裂解型態的Bid 出現，於 15 kDa 位置，隨著時間的增加而有遞增現象。顯示出 rhein 也會藉由 Fas 活化 caspase-8 之後，裂解細胞質中 Bid 進而與粒腺體上 bcl-2 結合來影響粒腺體膜電位，以進行粒腺體凋亡路徑。

三、NF-κB 之蛋白質表現

NF-κB是細胞核中重要的轉錄因子（transcription factor），並與發炎反應、細胞 週期的調控、細胞分化與細胞凋亡有關（Baeuerle

et al

., 1996; Ghosh

et al

., 1998）。

一般NF-κB是存在細胞質中，並且與其抑制劑IκB結合在一起，成不具活性型式，當 IκB被IκB kinase磷酸化，接著會被E3 ubiquitin ligase進行ubiquitination，並且會被 proteasome降解而釋出NF-κB，游離的NF-κB即可translocate至細胞核中，影響相關 基因轉錄作用。本實驗亦探討rhein對細胞核內重要轉錄因子NF-κB之影響。人類子 宮頸癌Ca Ski細胞以50 µM rhein處理，經6、12、24及48小時後，收集細胞萃取total protein，以Western blot分析NF-κB p65及NF-κB p50相關蛋白表現。結果顯示，（圖 4-39）NF-κB p65在6及12小時表現量並無明顯改變，在24及48小時後就有明顯表現

量降低現象。（圖4-40）NF-κB p50蛋白表現量於6和12小時有降低表現，24小時上 升，48小時降低。

圖4-31. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 bax 蛋白 之相對表現量

Figure 4-31. Western blotting analysis of bax expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in bax in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in bax level.

C 6 12 24 48

（h）

50 µM of rhein

bax β-actin

bax

Time (h)

0 6 12 24 48

bax/β-actin

0 1

B. 2

A.

圖4-32. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 bcl-2 蛋白 之相對表現量

Figure 4-32. Western blotting analysis of bcl-2 expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in bcl-2 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in bcl-2 level.

Bcl-2

β-actin

C 6 12 24 48

（h）

50 µM of rhein

bcl-2

Time (h)

0 6 12 24 48

Bcl-2/β-actin

0 1 2

A.

B.

圖 4-33. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 cytochrome

c

蛋白之相對表現量

Figure 4-33. Western blotting analysis of cytochrome

c

expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in cytochrome

c

in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in cytochrome

c

level.

Cytochrome c

Time (h)

0 6 12 24 48

Cytochrome c /β-actin

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

β-actin Cytochrome c

C 6 12 24 48 50 µM of rhein

A.

B.

圖4-34. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 caspase-9 蛋白之相對表現量

Figure 4-34. Western blotting analysis of caspase-9 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in caspase-9 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in pro-caspase-9 （46 kDa）level. （C）Relative changes in caspase-9（34 kDa） level.

pro-caspase-9 (46 kDa)

Time (h)

Caspase-9 (34 kDa)

Time (h)

0 6 12 24 48

caspase-9 /β-actin ratio

0.00

圖4-35. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 caspase-9 蛋白之相對表現量

Figure 4-35. Western blotting analysis of caspase-9 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in caspase-9 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in pro-caspase-3 （32 kDa）level. （C）Relative changes in caspase-3（17 kDa） level.

β-actin

圖4-36. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Fas 蛋白 之相對表現量

Figure 4-36. Western blotting analysis of Fas expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Fas in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Fas level.

β-actin

C 6 12 24 48 50 µM of rhein

Fas

Fas

Time (h)

0 6 12 24 48

Fas/β-actin

0 1 2

A.

B.

圖4-37. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 pro-caspase-8 蛋白之相對表現量

Figure 4-37. Western blotting analysis of pro-caspase-8 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in caspase-8 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in pro-caspase-8 level.

（續）

Caspase-8

β-actin

pro-caspase-8 (55 kDa)

Time (h) Active form

Active form

A.

B.

圖4-38. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 caspase-8 蛋白之相對表現量

Figure 4-38. Western blotting analysis of caspase-8 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in caspase-8 in Ca Ski cells at different periods of time.（C）Relative changes in caspase-8（46 kDa） level. （D）Relative changes in caspase-8（26 kDa） level.

Caspase-8

β-actin

caspase-8 (46 kDa)

Time (h)

caspase-8 (26 kDa)

Time (h) Active form

Active form

A.

C. D.

圖4-39. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 Bid 蛋白 之相對表現量

Figure 4-39. Western blotting analysis of Bid expression.（A）Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in Bid in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in Bid level.（C）Relative changes in tBid level.

tBid (15 kDa)

Time (h)

圖4-40. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 NF-κb p65 蛋白之相對表現量

Figure 4-40. Western blotting analysis of NF-κB p65 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in NF-κB p65 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in NF-κB p65 level.

C 6 12 24 48 50 µM of rhein

β-acti NF-κb p65

NF-kb p65

Time (h)

0 6 12 24 48

NF-kb p65 /β-actin

0 1 2

B.

A.

圖4-41. 以西方點墨法分析 Ca Ski 細胞經 50 µM rhein 處理後細胞中 NF-κb p50 蛋白之相對表現量

Figure 4-41. Western blotting analysis of NF-κB p50 expression. （ A ） Representative Western blotting showing rhein（50 µM）-induced change in NF-κB p50 in Ca Ski cells at different periods of time.（B）Relative changes in NF-κB p50 level.

第五章 討論

大黃酸rhein（4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid）是傳統的中醫藥 大黃（rhubarb）根莖中的一種蒽醌類（anthraquinone）化合物，並且已有文獻報 導，rhein可以抑制大鼠肝臟腫瘤細胞生長（Miccadei

et al

., 1993），以及在體外試 驗中抑制人類神經膠質瘤（human glioma）（Delpino

et al

., 1992）、Ehrilich 腹 水癌（ascites tumor）、人類大腸腺癌單層細胞（Raimondi

et al

., 2002）及人類原 骨髓血癌細胞（HL-60）（Lin

et al

., 2003）生長。這些研究顯示，rhein誘導細胞生 長之抑制作用可能與細胞凋亡所造成的細胞死亡有關。但在rhein對於人類子宮頸癌 Ca Ski細胞是否能夠有效抑制並無足夠資料。

本研究中以人類子宮頸癌Ca Ski細胞之體外模式（in vitro）探討大黃酸之腫瘤 抑制作用。2003年Lin 等人探討rhein誘導HL-60細胞凋亡機制探討時，所使用的藥 物劑量為25、50、75及100 µM，且rhein誘導HL-60細胞凋亡的有效劑量為100 µM rhein處理6小時。因此我們研究當中所選用的劑量範圍為5、10、25、50、100 µM。

我們的結果指出，rhein可以誘導人類子宮頸癌Ca Ski細胞細胞凋亡，於50 µM處理 48小時後可以發現DNA fragmentation（圖4-17）之現象。在傳統中醫當中，使用大 黃根（rhubarb root）來治療許多的癌症，像是胃癌、血癌及肝癌，平均每日劑量 為2-20 g的粉劑（Campbell

et al

., 2002; Ji, 1999）。大黃根中含有3-12%的蒽醌類

（anthraquinones）其中含有60-80%的rhein、emodin及aloe-emodin（大約等於在 血液當中的濃度為400 µM）。因此，本實驗中所使用的劑量可以從每日大黃根的治 療劑當中獲得。並且，本研究中所使用的劑量50 µM rhein處理48小時後，誘導子宮 頸癌細胞apoptosis，明顯比大黃根治療劑量來的低，顯示可以用50 µM rhein這種低 劑量且長時間的治療方針來誘導細胞的凋亡作用。

rhein之抗腫瘤作用不僅造成人類子宮頸癌Ca Ski細胞生長抑制、存活率降低、

細胞週期停滯，也促使人類子宮頸癌Ca Ski細胞凋亡，rhein對人類子宮頸癌Ca Ski 細胞生長抑制的影響（圖4-1~6），可以看出處理不同濃度之rhein皆會抑制人類子 宮頸癌細胞生長，Ca Ski細胞在處理5、10和25 µM的rhein，經過12小時有明顯生長 抑制的現象發生，於50 µM的rhein處理6小時可以看到生長停滯現象（圖4-6B），

於12小時候開始有存活率降低情形出現，24及48小時後發現培養的細胞數目減少，

細胞死亡的現象發生，72小時之後大約只剩30%的存活率，且也可以明顯從型態上 發現凋亡小體。因此，大黃酸rhein對人類子宮頸癌Ca Ski細胞之作用一開始6、12 小 時 可 能 是 造 成 生 長 停 滯 ， 之 後24 、 48 及 72 小 時 會 造 成 細 胞 的 自 體 凋 亡

（apoptosis）。

細胞apoptosis時，會有型態（morphology）上的改變，細胞會圓起、染色質濃 縮（chromatin condensation），死亡的細胞漂起，我們可由圖4-1A~6A都可看到細 胞數減少，細胞型態上改變，所以rhein不僅造成人類子宮頸癌細胞生長停滯也促使 子宮頸癌細胞凋亡。

以PI染色利用流式細胞儀（Flow cytometer；FACS）分析大黃酸rhein對人類子 宮頸癌Ca Ski細胞DNA含量的分佈情形，得知細胞週期分佈情形。結果發現，以不 同濃度之rhein處理12、24、48及72小時後，細胞DNA分佈，隨著濃度的增加於24 小時後就有發生顯著的G0/G1 phase arrest和apoptsis。此外，又以50 µM rhein處理 Ca Ski細胞，經6、12、24、48及72小時，結果顯示，（圖4-11）rhein處理組在24 小時G0/G1 phase的細胞數目（82.43±7.56%）有顯著的比控制組（62.43±4.9%）

來得高，S phase及G2/M phase也有減少的趨勢發生，且隨著時間的增加G0/G1 phase 比例越趨增加，S phase越趨下降，甚至只剩下G0/G1及sub-G1 peak而已，此現象似 乎是細胞無法進入S phase而使細胞週期停滯在G1 phase。除此之外，我們更在48

及72小時的細胞DNA分佈上明顯看到sub-G1 peak，表示細胞產生了細胞凋亡情形。

綜合上述這些結果說明了大黃酸rhein不僅造成了人類子宮頸癌Ca Ski細胞cell cycle arrest，也促使人類子宮頸癌細胞apoptosis。

除此之外，大黃酸所造成人類子宮頸癌Ca Ski細胞的這些作用也會造成細胞型 態上的改變，這些改變是否符合細胞凋亡的型態標準，可以藉由DAPI染色來確認。

除此之外，大黃酸所造成人類子宮頸癌Ca Ski細胞的這些作用也會造成細胞型 態上的改變，這些改變是否符合細胞凋亡的型態標準，可以藉由DAPI染色來確認。

在文檔中 大黃酸誘導人類子宮頸癌細胞Ca Ski細胞週期停滯及細胞凋亡作用之探討; Rhein Induced Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Cervical Epidermoid Carcinoma Ca Ski Cell Line (頁 106-128)