第三章 實驗材料及方法
3. 實驗步驟：
將細胞種植於10cm plate 中，細胞依照 2×106 /well 種植於培養皿中，每 well medium 總量為 10 ml，經過 24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入 5 mM
rhein ，100 µl/well 到 6 well plate 當中，經不同時間培養（24、48 及 72 h）
; 加藥時間後，收細胞，將上層液移至離心管中，加入 PBS 清洗細胞一次後，
再將細胞以trypsin 處理，置於 37℃培養箱中處理 2 分鐘後，將細胞打下來，
加入1 ml PBS 以中和 trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 離心5 分鐘，去除上清液，再加入 1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心 5 分鐘，
倒掉上清液 ，加入 200 µl PBS 混合均勻將細胞移至 eppendorf，14000 rpm 離心1 分鐘，小心移去上清液，加入 200 µl PBS or TE buffer，將細胞懸浮均 勻，再加入4 µl RNase A（10 mg/ml），室溫靜置 5 min，將細胞中 RNA 溶解，
再加入Proteinase K 20 µl，及 Binding solution 200 µl，置於 70℃水浴，10 min，
再加入100% EtOH 200 µl，votex 均勻（若此時液體呈現濃稠白色黏液狀，則 細胞數過多，會降低DNA 抽取的效果），transfer 至 Spin column，14000 rpm 離心1 分鐘（離心後 DNA 會 binding 到 spin column 中間白色那層），再加入 300 µl Binding solution，14000 rpm 離心 1 分鐘，再以 700 µl Washing solution 清洗兩次（14000 rpm 離心 1 分鐘），最後一次將column 中所有液體都離下來，
不加任何solution 直接 14000rpm 離心 5min，再置於烘箱 3~5 min，將 column 由烘箱中取出後，加入100 µl Elution solution（Elution solution 需先置於 70ºC 水浴加熱，可增加DNA 溶解性，直到欲使用前再取出），室溫靜置 2 分鐘後，
14000rpm 離心 5min，離下液體即是含有 DNA 之 solution。
跑膠：
將DNA 與 6× DNA loading dye 混合（10 µl DNA solution＋2 µl 6× DNA loading dye）loading 至 2% agarose（1g agarose、50ml 0.5× TBE buffer、10 µl Eithidium bromide）中。進行電泳，最後放入 UV light 下檢查並照相儲存。
六、細胞蛋白質之萃取（Protein extraction）
（一）細胞總蛋白之製備
1. Protein Extraction Solution（lysine buffer）
PRO-PREP for Cell/Tissue 2. 實驗步驟
將細胞種植於6 well plate 中，細胞依照 5×105 /well 種植於培養皿中，每 well medium 總量為 3 ml，經過 24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入 5 mM rhein ，30 µl/well 到 6 well plate 當中，經不同時間培養（6、12、24 及 48h），
加藥時間後，收細胞，將上層液移至離心管中，加入PBS 清洗細胞一次後，再 將細胞以trypsin 處理，置於 37℃培養箱中處理 2 分鐘後，將細胞打下來，加 入1 ml PBS 以中和 trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 離 心5 分鐘，去除上清液，再加入 1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心 5 分鐘，
倒掉上清液 ，小心將 PBS 吸乾，再加入 100 µl lysine buffer，將細胞懸浮均勻，
置於-20℃ overnight，之後離心（14000 rpm，20min）取上清液，為 lysine buffer 與細胞蛋白混合之液體，再去進行蛋白質含量測量。
（二）蛋白質濃度測定
1. 蛋白質標準品檢量線製作
以Bradford 定量法（Bradford, 1976），使用胎牛血清白蛋白（Bovine serum albumin; BSA）當作蛋白質標準品，利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D. 595 nm 來測量蛋白質標準品吸光值來做檢量線（standard curve），以蛋 白質標準品吸光值畫出標準品檢量線，並求出趨勢線方程式及r2值。
表3-8. 蛋白質標準品之配製
先取Bradford染劑2 ml加8 ml二次水（5×稀釋）混合均勻備用，取15 µl配 製好蛋白質標準品（BSA）加735 µl Bradford染劑混合均勻，置於96 well plate 中，每well加入200 µl（三重複），靜置5 min後以O.D.595 nm測量吸光值，測 得標準品之吸光平均值，以O.D. value（Y）對蛋白濃度 µg/mL（X），求出趨 勢線方程式---y=a x + b，r2值要趨近於0.99。
2. 樣品蛋白質定量
取15 µl sample protein 與 735 µl 的 Bradford 染劑（5 倍稀釋）混合，反 應5 分鐘後，同蛋白質標準品一起測定吸光值，所得之吸光值平均，帶入 y 值
（y=a x + b），求出該 sample 的蛋白質濃度（µg/ml）。
蛋白質濃度
（µg/ml）
100 µg /ml BSA
（ml） DDW（ml）
100 500 0
80 400 100
60 300 200
40 200 300
20 100 400
0 0 500
七、SDS-PAGE 電泳分析 1. 電泳膠片製作
表 3-9. SDS-PAGE 下層膠（Separation gel）之配製及組成
表3-10. SDS-PAGE 上層膠（Stacking gel）之配製及組成
組成 Stacking gel
（四片量）
H2O 4.06 ml
40％ Acrylamide/Bis（29:1） 1.02 ml Stacking buffer 1.66 ml 10％ SDS 66 µl 10％ APS 33.4 µl
TEMED 12 µl
表3-11. Running buffer（1.5M Tris-HCl, pH8.8）之組成
組成 重量
Tris 36.3 g
DDW 150 ml
HCl 調整至pH8.8
加DDW 到總體積 200 ml
組成 10％ Separation gel
（四片量）
12％ Separation gel
（四片量）
表3-12. Stacking buffer（0.5M Tris-HCl, pH6.8）之組成
組成 重量
Tris 3 g
DDW 40 ml
HCl 調整至pH6.8
加DDW 到總體積 50 ml
2. 實驗步驟
將蛋白質依分子量分離利用 SDS-PAGE，將配製好的下層膠 Separation gel 注入鑄膠台中，再以 isopropanol 去除氣泡並壓平下膠，靜置一段時間，可觀 察管子當中的剩餘下層膠是否凝固，待下層膠凝固後，將 isopropanol 倒掉，
注入上層膠並插上 comb，並避免氣泡產生，待上層膠凝固後，將鑄好膠體放 置於電泳槽中，加入電泳緩衝液（running buffer；表 3-10），接著將將萃取出 的蛋白質與5X protein loading dye 混合並以 100℃加熱 10 min 後，冰上冷卻 後離心，依序將標示標準分子量的Multimaker 5 µl 及各 sample 18 µl 注入膠體 的孔槽中，通以電壓80 Volts，待樣品通過 stacking gel 後，電壓調為 110 Volt，
進行以電泳，當SDS-PAGE 染劑跑出 SDS-PAGE 後或可視其需要，即可關掉電 源。
表3-13. 電泳緩衝液（running buffer）之組成
組成 重量
10X SDS buffer（25mM Tris、192 mM glycine、0.1％ SDS）
200 ml
加DDW 到總體積 2000ml
八、西方點墨法（Western blotting）
（一）轉漬步驟：
先將PVDF membrane裁剪好，再以methanol短暫濕潤後，再浸入轉印緩衝液
（transfer buffer；表3-11）中，接著將裁好的濾紙先浸泡在transfer buffer中備用，
將轉漬夾打開後，黑色面朝下，將海綿墊片先以transfer buffer潤濕並鋪在黑夾上，
再將3M濾紙鋪上，接下來裁剪下層膠（separation gel）中所要轉漬的區域後，將 SDS-PAGE gel小心的鋪於3M濾紙上，可在濾紙上加入多量的transfer buffer，再鋪 上SDS-PAGE gel時勿陷入任何氣泡，再依序放上PVDF membrane，同樣避免氣泡產 生，及3M濾紙，最後再放上一片海綿墊片，即可把整個轉漬夾裝好，形成似三明治 夾層狀之構造（圖3-5）。置入已裝有transfer buffer的電泳槽中將黑夾朝負極，紅夾 朝正極，電泳槽外圍放置足夠冰塊，使整各系統維持低溫狀態。以400 mA、2小時 的條件下進行蛋白質轉漬步驟。
轉印完成後取出轉印膜裁去多餘部分，轉印膜後以0.05% tween 20/1X PBS 清 洗10分鐘共3次。緊接將轉印膜以2% FBS（溶於0.05 % tween 20/1X PBS 中）進 行blocking 步驟，以室溫1小時為條件進行。取出轉印膜後於小盒中以0.05 % tween 20/1X PBS 清洗10分鐘共3次。倒掉清洗液，加入8 ml的一級抗體（溶於新鮮配製 之blocking solution中，稀釋倍數依不同抗體有所不同），4 ℃隔夜進行搖盪。隔天 取出，回收一級抗體，以0.05% tween 20/1X PBS 清洗轉印膜10分鐘共3次。加入8 ml 稀 釋 10000 倍 的 goat anti IgG （ HRP ） horseradish peroxidaseconjugated antibody 二級抗體（溶於含2% FBS的0.05% tween 20/1X PBS中），於室溫下搖 盪進行1小時，最後取出轉印膜後以0.05% tween 20/1X PBS 洗清洗10分鐘共3次。
（二）壓片步驟：（暗房中進行）
將轉印膜浸泡於ECL 試劑之混合液（每瓶各取1.5 ml等比例混合）中1分鐘反 應。以兩張投影片黏貼固定於cassette 內，轉印膜並正面朝上放置於壓片卡匣
（cassette）兩張投影片中間，以Hyperfilm 軟片置於上層投影片上，對準轉印膜進 行壓片，感光時間依轉印膜上螢光亮度決定時間長短，約5 秒至1 小時不等。感光 完成後放入顯影劑進行顯影步驟（時間依實際觀察決定），再以清水沖洗30秒後放 入定影劑中，過30 秒後再以清水沖洗30 秒。
表3-14. 轉印緩衝液（Transfer buffer）之組成
組成 重量
Tris 4.5 g
Glycin 21.6 ml
methanol 300 ml
加DDW 到總體積 1500 ml
紅、正極（＋）
黑、負極（－）
圖3-6 轉漬夾內部組成
海綿墊片 3M paper PVDF membrane
SDS-PAGE gel 3M paper
海綿墊片
表3-15. PBS-tween 20 之組成
組成 重量
Tween 20 500 µl
PBS 1000 ml
九、統計分析（Statistics analysis）
實驗結果以平均值標準差（mean ± SD）表示，使用Student’s
t
-test 來決定實 驗組與對照組之差異。*表示p
＜0.05，表示統計上具顯著差異。第四章 結果
本實驗以探討大黃酸（rhein）對人類子宮頸癌細胞 Ca Ski 細胞之影響，首先 測試大黃酸對Ca Ski 細胞之生長抑制率及存活率之影響，及藉由型態（morphology）
上觀察細胞之變化，再更進一步利用DAPI 染色及單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis； Comet assay）觀察細胞是否有細胞損傷（DNA damage）情形發 生及細胞凋亡（apoptosis）現象。接下來再探討大黃酸對 Ca Ski 細胞細胞週期影響，
並利用DNA 斷裂分析（DNA fragmentation）、粒線體膜電位（∆Ψm）、活性氧化物 產生（ROS products）、鈣離子釋放（calcium release）、以及凋亡蛋白 caspase-3 活性之檢測，來做凋亡路徑探討，最後再以Western blot 來檢測凋亡蛋白質表現，
以探討大黃酸對Ca Ski 細胞凋亡之影響。