大黃酸（rhein）對人類子宮頸癌細胞株（Ca Ski）細胞週期之影響

已知細胞的增生與分裂是遵循著細胞週期的進行，整個細胞週期可分為G0/G1、 S、G2及M期，由上述實驗得知大黃酸具有抑制子宮頸癌細胞（Ca Ski）生長之能力，

且大黃酸會影響細胞存活率的降低，於型態學觀察上亦可發現凋亡細胞的存在，此 現象有可能是透過阻止了細胞週期的進行，因此利用PI核酸染劑將細胞DNA染色，

以流式細胞儀（flow cytometry）分析不同濃度之大黃酸對（5、10、25、50、100 µM）

是否會對Ca Ski細胞株影響細胞週期的進行。藉由DNA含量的分佈，可以得知細胞 所在之時期。G0/G1期細胞之染色體數目為2N，S期細胞為DNA合成與複製時期，其 DNA含量介於G0/G1 phase與G2/M phase（2N~4N）之間，至G2/M期細胞已複製完 成含有4套的染色體（4N）。此外，在G0/G1 pahse前有不成套（Aneploid）之染色體 出現則為sub-G1 peak，由於細胞apoptosis之後受內切酶酵素（endonucleases）作 用，會將DNA切斷（Hanif

et al

., 1996 and Zhang

et al

., 2000），故sub-G1 peak可 做為細胞apoptosis的分佈比例。

本實驗是將不同濃度（0, 5, 10, 25, 50, 100 µM）大黃酸投予 Ca Ski 細胞，將 細胞種植於12 well plate 中，細胞依照 2×10⁵/well 種植於培養皿中，經過 24 小時 靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的rhein 10 µl/ml 培養液（0.5 mM、1 mM、

2.5 mM、5 mM、10 mM）（其最終濃度分別為 5、10、25、50、100 µM），分別培 養12、24、48 及 72 小時。

一、給予大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞週期之影響—分析 12 小時細胞週期分 佈情形

給予不同濃度之大黃酸（rhein）於 12 小時後觀察人類子宮頸癌細胞週期之變 化（圖4-7），圖 4-7A.為以不同濃度之大黃酸處理 12 小時後之 Ca Ski 細胞細胞週 期分佈情形。圖 4-7B.為細胞週期所佔每一個時期以百分比表示。結果發現在低濃

度時（5、10 µM）其 G2/M phase 細胞分佈比例為 11.18 ± 1.22%及 13.97 ± 1.69%，

有明顯的高於控制組G2/M phase 6.20 ± 1.38%的比例（

p

<0.05），到高濃度時（25、

50、100 µM）G2/M phase，又有降低的情形發生。而在 G0/G1 期上，大黃酸並未 對Ca Ski 細胞週期 G0/G1 期的分佈有明顯影響，於高濃度時（25、50、100 µM）

G0/G1 期有上升的現象，但尚未達到顯著上的差異。

另外，不同濃度（5、10、25、50 及 100 µM）大黃酸處理之 Ca Ski 細胞之 sub-G1

（apoptosis）比例（圖 4-7C.）分別為 4.29 ± 1.19%、5.29 ± 1.64%、6.22 ± 2.41%、

4.72 ± 1.10%及 12.37 ± 5.38%，皆比控制組的 0.8967 ± 0.7245%來得高。

二、給予大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞週期之影響—分析 24 小時細胞週期分 佈情形

給予不同濃度之大黃酸（rhein）於 24 小時後，觀察人類子宮頸癌細胞週期之 變化（圖4-8），圖 4-8A.為以不同濃度之大黃酸處理 12 小時後之 Ca Ski 細胞細胞 週期分佈情形。圖 4-8B.為細胞週期所佔每一個時期以百分比表示。結果發現在低 濃度時（5、10、25 µM）其 G0/G1 期分別為80.62% ± 2.07、82.53% ± 1.93 及 83.66%

± 1.93，顯著高於控制組 72.57% ± 1.98（

p

<0.05），以及在S 期分佈已有明顯下降，

顯示出G0/G1 期停滯。

另外，不同濃度（5、10、25、50 及 100 µM）大黃酸處理之 Ca Ski 細胞之 sub-G1

（apoptosis）比例（圖 4-8C.）分別為 6.81 ± 3.3%、8.87 ± 3.2%、11.8 ± 4.4%、

16.2 ± 3.9%、28.2 ± 6.3%，皆比控制組的 0.15 ± 0.05%來得高。

三、給予大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞週期之影響—分析 48 小時細胞週期分 佈情形

給予不同濃度之大黃酸（rhein）於 48 小時後，觀察人類子宮頸癌細胞週期之

變化（圖4-9），圖 4-9A.為以不同濃度之大黃酸處理 12 小時後之 Ca Ski 細胞細胞 週期分佈情形。圖 4-9B.為細胞週期所佔每一個時期以百分比表示。結果發現在低 濃度 5 µM 之 rhein 處理後，其 G0/G1期分佈佔91.41% ± 1.49，顯著高於控制組 70.61% ± 0.22（

p

<0.05），並且隨著濃度的增加，G0/G1 期細胞分佈比例也都持 續偏高，且S 期也呈現降低的趨勢，於低濃度（5 µM）可以明顯看出只剩下 G0/G1 期 的分佈而已（圖4-9A），由此可知，大黃酸誘導人類子宮頸癌Ca Ski 細胞停滯於 G0/G1

期，使得細胞週期無法通過G0/G1進入到S 期。

另外，不同濃度（5、10、25、50 及 100 µM）大黃酸處理之 Ca Ski 細胞之 sub-G1

（apoptosis）比例（圖 4-9C.）分別為 8 ± 2%、6.5 ± 1.2%、11.2 ± 5%、25 ± 6.8%

及30.9 ± 4.2%%，皆比控制組的 0.3 ± 0.4%來得高。

四、給予大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞週期之影響—分析 72 小時細胞週期分 佈情形

給予不同濃度之大黃酸（rhein）於 72 小時後，觀察人類子宮頸癌細胞週期之 變化（圖4-10），圖 4-10A.為以不同濃度之大黃酸處理 12 小時後之 Ca Ski 細胞細 胞週期分佈情形。圖4-10B.為細胞週期所佔每一個時期以百分比表示。結果顯示其 G0/G1期分佈隨著濃度的增加而增加，而且S 期也有呈現降低的現象，於低濃度 5 µM 大黃酸處理後就發生顯著的G0/G1 phase arrest 及 apoptosis。由此可知，大黃酸誘 導人類子宮頸癌Ca Ski 細胞停滯於 G0/G1期，使得細胞週期無法通過G0/G1進入到 S 期。

另外，不同濃度（5、10、25、50 及 100 µM）大黃酸處理之 Ca Ski 細胞之 sub-G1

（apoptosis）比例（圖 4-10C.）分別為 14.6 ± 0.7%、21.2 ± 0.7%、27.5 ± 3.8%、

26.8 ± 3.4%及 23.9 ± 3.9%，明顯高於 0.2 ± 0.2%。而在 100 µM 大黃酸投予下 sub-G1細胞分佈比例反而變少的原因為，在細胞試驗當中，凋亡細胞最終並無巨噬

細胞來吞噬，因此，在體外試驗中凋亡細胞依然是會走向壞死（necrosis），而使得 流式細胞儀分析出來sub-G1比例降低。

五、給予 50 µM 大黃酸對人類子宮頸癌細胞之細胞週期之影響是否呈現時間依賴 關係

以50 µM 大黃酸（rhein）處理 Ca Ski 細胞，於不同時間後，觀察人類子宮頸 癌細胞週期之變化（圖4-11），圖 4-11A.為以不同濃度之大黃酸處理 12 小時後之 Ca Ski 細胞細胞週期分佈情形。圖 4-11B.為細胞週期所佔每一個時期以百分比表 示。結果顯示在50 µM 大黃酸（rhein）處理 Ca Ski 細胞後，6 及 12 小時的細胞週 期與控制組比較並無明顯改變，在24 小時大黃酸處理後，G0/G1期的細胞數目佔 82.43 ± 7.56%，比控制組的 62.43 ± 4.9%來得高（

p

<0.05），而 24、48 及 72 小 時大黃酸處理組的S 期也有降低的現象，甚至到 72 小時只可明顯看見 G0/G1期的 分佈存在。此結果顯示，大黃酸處理後細胞無法進入S 期而使細胞週期停滯在 G0/G1

期。

另外， 50 µM 大黃酸處理不同時間（6、12、24、48 及 72h）之 Ca Ski 細胞 之sub-G1（apoptosis）比例（圖 4-11C.）分別為 8.9 ± 5.7%、13 ± 2.8%、30.6 ± 7.4%、47 ± 8.3%及 85.5 ± 2.8%，顯著高於控制組的 0.2 ± 0.17%。（

p

<0.05）

圖4-7. 不同濃度之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響—12 小時

（續下頁）

Cell Numbers

DNA Content

4.96% Apoptosis

25 µM

50 µM

3.88% Apoptosis

Control

5 µM

5.50% Apoptosis

6.76% Apoptosis

10 µM

16.17% Apoptosis

100 µM A.

Concentration of rhein ( µΜ )

C 5 10 25 50 100

Cell Cycle Distribution (%)

0

Concentration of rhein ( µΜ )

C 5 10 25 50 100

12h Apoptosis *

圖4-7. 不同濃度之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響—12 小時

Figure 4-7. Effects of rhein on the cell cycle in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 12 hours, and they were harvested and were analysis by flow cytometry as described in materials and methods. Results are means ± S.D, n=3. The significant differences between control groups were analyzed by Student’s

t

-test. *

P

< 0.05.

B.

C.

圖4-8. 不同濃度之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響—24 小時

（續下頁）

DNA Content Control

11.5% Apoptosis

25 µM

14.83% Apoptosis

50 µM

16.71% Apoptosis

100 µM

24.99% Apoptosis 8.58% Apoptosis

5 µM

10 µM

Cell Number

A.

B.

24h cell cycle

Concentration of rhein (µΜ)

c 5 10 25 50 100

Cell cycle distribution (%)

0

Concentration of rhein (µΜ)

0 5 10 25 50 100

Figure 4-8. Effects of rhein on cell cycle in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 24 hours, and they were harvested and were analysis by flow cytometry as described in materials and methods. Result are means ± S.D, n=3. The significant differences between control groups were analyzed by Student’s

t

-test. *

P

< 0.05.

圖4-9. 不同濃度之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響—48 小時

（續下頁）

DNA Content Control

25 µM

15.38% Apoptosis

50 µM

30.81% Apoptosis

100 µM

35.33% Apoptosis 7.65% Apoptosis

5 µM

10 µM

10.38% Apoptosis

Cell Number

A.

48h cell cycle

Concentration of rhein ( µΜ )

C 5 10 25 50 100

Cell cycle Distribution (%)

-20

Concentration of rhein ( µΜ )

C 5 10 25 50 100

Figure 4-9. Effects of rhein on cell cycle in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 48 hours, and they were harvested and were analysis by flow cytometry as described in materials and methods. Result are means ± S.D, n=3. The significant differences between control groups were analyzed by Student’s

t

-test. *

P

< 0.05.

B.

C.

圖4-10. 不同濃度之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響—72 小時

（續下頁）

DNA Content Control

50 µM

100 µM 25 µM

26.98% Apoptosis

29.10% Apoptosis

28.12% Apoptosis

10 µM

22.02% Apoptosis 14.25% Apoptosis

5 µM

Cell Number

A.

72h cell cycle

Concentration of rhein ( µΜ )

c 5 10 25 50 100

Cell Cycle Distribution (%)

-20

Concentration of rhein ( µΜ )

0 5 10 25 50 100

Figure 4-10. Effects of rhein on cell cycle in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with various concentrations of rhein for 72 hours, and they were harvested and were analysis by flow cytometry as described in materials and methods. Result are means ± S.D, n=3. The significant differences between control groups were analyzed by Student’s

t

-test. *

P

< 0.05.

B.

C.

圖4-11. 50 µM 之大黃酸 rhein 對 Ca Ski 細胞週期分佈影響

（續下頁）

6h Control

DNA Content

Cell Number

6.12% Apoptosis

48h 72h

12.73% Apoptosis 22.06% Apoptosis

38.30% Apoptosis

A.

82.61% Apoptosis

12h 24h

Time Course

Time (h)

0 6 12 24 48 72

Cell Cycle Distribution (%)

-20

Figure 4-11. Effects of rhein on cell cycle in Ca Ski cells. The Ca Ski cells were incubated with 50 µM of rhein for 0~72 hours, and they were harvested and were analysis by flow cytometry as described in materials and methods. Result are means ± S.D, n=3. The significant differences between control groups were analyzed by Student’s

t

-test. *

P

< 0.05.

B.

C.

第四節 大黃酸（rhein）誘導人類子宮頸癌細胞株（Ca Ski）細胞凋亡之探 討

一、利用DAPI 染色檢測凋亡細胞

DAPI（4 -6-diamidine-2-phenyl indole）是種核酸螢光染劑，其會專一性的 binding 在 DNA 雙股螺旋之小溝（minor groove）上，當細胞凋亡時會出現染色質 凝結（chromosomes condensation ）、DNA 斷裂（DNA fragmentation）情形發生，

若細胞凋亡越嚴重，則DNA 斷裂越多而 DAPI 染劑就會染上越多，在螢光顯微鏡下 可觀察到白色螢光強度就越亮。

人類子宮頸癌Ca Ski 細胞以不同濃度（0、5、10、25、50、100 µM）之大黃 酸rhein 處理 12 和 24 小時後，收集細胞以 DAPI 染劑將細胞染色，利用位像差顯 微鏡，觀察螢光強度。我們更進一步檢視細胞死亡是否是經由細胞凋亡路徑，我們 由DAPI staining assay，將 DNA 雙股螺旋小溝（minor groove）上接上 DAPI 螢光，

在螢光顯微鏡下觀察，與對照組比較，大黃酸處理組螢光明顯增加，由圖 4-12 於 12 小時大黃酸 rhein 給予下，隨著的濃度增加可發現螢光強度有增加的現象，白色 螢光明顯比控制組亮；於24 小時大黃酸給予下（圖 4-13），可以看到隨著濃度的增 加有明顯白色螢光增強的趨勢出現，可明顯看出凋亡小體（apoptotic body）的細 胞出現。顯示大黃酸rhein 會造成人類子宮頸癌 Ca Ski 細胞 DNA fragmentation 而 造成凋亡。

在文檔中 大黃酸誘導人類子宮頸癌細胞Ca Ski細胞週期停滯及細胞凋亡作用之探討; Rhein Induced Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Cervical Epidermoid Carcinoma Ca Ski Cell Line (頁 62-76)