第三章 基本理論
4.2 實驗前準備
4.2.1 培養基質的配製
本研究所使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組 成，配製方法如下。
將下列 1 ~ 7 的貯備液 (Stock Solution)各加 1 ml 至含 900 ml 去離子水中，再稀釋至 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營養基質之 pH 值調至 7.50 ±0.10，用錫箔紙包覆後置於 4℃冰箱中保存。
1. 硝酸鈉貯備液：溶解 12.750 g NaNO3 於 500 ml 去離子水。
2. 氯化鎂貯備液：溶解 6.082 g MgC12．6H2O 於 500 ml 去離子水。
3. 氯化鈣貯備液：溶解 2.205 g CaCl2．2H2O 於 500 ml 去離子水。
4. 微營養鹽貯備液：共配製 stock1 (100％ EDTA)、 stock2 (10％
EDTA)和 stock3 (0％ EDTA)三瓶不同編號的貯備溶液，100﹪是 使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培養藻類時使用10﹪，進 行實驗時則使用不含EDTA 之貯備液。每瓶的配法為先秤取下列 七種藥品加入500 ml 去離子水中，
92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12．6H2O 207.690 mg MnCl2．4H2O 3.630 mg Na2MoO4．2H2O
1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2．2H2O 79.880 mg FeC13．6H2O
加完後，再加入螫合劑（EDTA），而所需加的量如下：
Na2EDTA．2H2O
stock1： 150 mg Na2EDTA．2H2O stock2： 15 mg Na2EDTA．2H2O
stock3： 不加
5. 硫酸鎂貯備液：溶解 7.350 g MgSO4．7H2O於 500 ml去離子水中。
6. 磷酸氫二鉀貯備液：溶解 0.522 g K2HPO4於500 ml去離子水中。
7. 碳酸氫鈉貯備液：溶解 7.5 g NaHCO3 於 500 ml 去離子水中。
其所含巨量及微量營養素濃度列於 Table 4.1 及 Table 4.2。營養 基質的滅菌是以 0.45μm 的濾膜過濾，過濾滅菌後的營養基質須保 存在 4 ℃ 且置 於陰暗無光線照射處，以免產生光化學反應。
Table 4.1 The consist of macro-algal medium
化合物 濃度(mg/l) 元素 各元素實際濃度
(mg/l)
NaNO3 25.5 C 2.14
NaHCO3 15.0 Na 11.0
P 0.186 K2HPO4 1.04
K 0.649
MgSO4-7H2O 14.7 S 1.91
MgCl2 5.7 Mg 2.9
CaCl2-2H2O 4.41 Ca 1.20
Table 4. 2 The consist of micro-algal medium
4.2.4 藻類之培養步驟及裝置
實驗物種Pseudokirchneriella subcapitata 在進行實驗前必須經過 2-7 天預培養(pre-culture)使之平均細胞體積(mean cell volume)達到 39-46 μm3 ，而藻類細胞數量達到 1.9~2.0×106 cells/mL，在此條件下 才取藻類進行實驗。在培養藻類最需注意的步驟為微營養鹽貯備液 的加入方法，一開始活化藻類加的是stock1 (100％ EDTA)，而在連 續式母槽中培養藻類時使用的是stock2 (10％ EDTA)，且第一瓶硝 酸鈉貯備液和第六瓶磷酸氫二鉀貯備液加入體積需為其它五瓶的一 半。此外液態營養基質中之藻類可在4℃下保存四個星期，於四個星 期之後做移植以繼續培養保存菌種。Fig 4.1 為培養步驟且本實驗條 件依據(Lin, J.H., 2001)所決定之適當的條件下進行，條件如下：
1. 溫度：藻類之培養及毒性試驗皆在 24 ± 1℃下進行。
2. 光度：藻類之培養及毒性試驗皆在光度為 64.5 ± 10% μEm-2s-1下 進行，所使用之光源為連續白冷光。
3. 氮、磷濃度：培養藻類時使用一半之濃度，毒性試驗時則不變。
4. HCO3濃度：15 mg/L。
5. pH：初始 pH 為 7.5 ± 0.1。
6. EDTA 含量：100%是使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培養 藻類時使用10%，進行實驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。
7. 試驗時間：四十八小時。
8. 藻類初始植種密度：1.5 × 104 cells / ml。
9. 振盪頻率：100 rpm。
Fig 4. 1 藻類培養步驟示意圖
4.2.5 ISOTON II 之配製
（Multisizer Accucomp V. 2.01）進行進一步的分析。電子顆粒計數器 主要條件設定如下 Table 4.3。本實驗採用 100µm 孔徑之毛細玻璃 管。
計數時，取 1ml 的藻液置入 50ml 之量瓶內，再加入 ISOTON II 至 50ml，然後倒入燒杯中，置入顆粒計數器內計數。以顯示之讀數
值扣除空白顆粒數之數值，即純 ISOTON II 之背景值，所取之值為 連續三次值相差在2%者之平均值。
Table 4.3 The conditions of Coulter Counter
項 目 數 值
滿刻度電流量 (Full scale) 10mA
極性 (Polarity) +
電流 (Currents , I) 100
粒度下限 (Diameter Lower Threshold , Tl) 2.177µm 粒度上限 (Diameter Lower Threshold , Tu) 6.975µm
脈衝衰減倍率 (Attenuation , A) 1
脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1
警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF 孔徑（Orifice Diameter） 100
孔長（Orifice Length） 75
分析量 500µL
Setup Manual
Kd 924
Size 5.00 E
Size unit µm