第二章 文獻回顧
2.1 藻類毒性試驗
2.2.5 試驗中的重要參數
生物實驗中其中一個重要的部分就是保持實驗條件的恆定，其 實驗結果才會有公信力，不然往往會因為實驗條件的變動造成實驗 結果的誤差，以下為本研究室實驗中所考慮的重要參數：
(1) 光照強度
光照的強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氣率 之不同。藻類毒性試驗之中，光照的強度依照不同的試驗標準及不 同藻種而有些許的差異。在實驗室培養藻類時必須要考慮「自身遮 蔽」效應 (self-shading)，此效應會造成距光源較遠處之光照與較近處 之光照強度之差異，良好的混合可以減低自身的遮蔽效應並使光照 有更好的利用效率。Nyholm et al. (1989)提到光照強度會影響藻類行 光合作用因此在藻類毒性試驗設計中如要使藻類維持在對數生長 期，則光照需設為常數。光照強度在良好的培養條件之下，並能使藻 類呈現指數生長、縮小培養體積及維持充分的混合有助於達到理想 狀態。本研究依(U.S.EPA Ecological Effect Test Guidelines, 1996)標準 方法針對Pseudokirchneriella subcapitata的規定，於連續式培養和批 次試驗中所選擇的光照的強度為64.5 ± 10% μEm-2s-1 (4300 lux)，且 以連讀式的光照來排除光暗交替循環式的光照所導致的藻類生物質 量變異的缺點。
(2) pH 值的控制
是否需要控制 pH 一直被廣為討論及研究但是用來預測在某特定 的pH 值狀況下之物種濃度影響困難度很高，因此標準藻類毒性試驗 皆傾向其pH 值維持在固定。
在毒理學的觀念，pH 值若變化一個單位，可能導致毒性改變 10 倍以上； pH 值控制值隨不同的標準方法而有差異，U.S. EPA 規定 最終 pH 值需在 8.5 之下(U.S.EPA Ecological Effect Test Guidelines, 1996) ， OECD 則 要 求 pH 值 之 最 大 變 動 不 要 超 過 一 個 單 位 (OECD,Guideline for testing chemicals, 1984)；ISO 則是要求 pH 值之 變動在 1.5 個單位之內(ISO, 1987)。若決定試驗在一固定 pH 值下進 行時，就必須小心地確保 pH 值之變化為最少。欲減少 pH 值之改 變，大致的方法有下列幾種：(1)使用較低之生物接種量 (2)縮短整 個試驗之時間 (3)以空氣或是添加二氧化碳之空氣加以曝氣(4)保持 良好通風。
(3) 溫度
當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長 溫度後即迅速下降。本研究採用U.S. EPA (U.S.EPA Ecological Effect Test Guidelines, 1996)建議的 24℃±1℃環境下來培養藻類來進行實 驗，整個培養及試驗過程中，溫度之變化不可大於2℃。
(4) 植種數量與時間
對批次式實驗而言，若實驗開始時的植種數量過高，將會造成實 驗後期由於藻類細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡，而導 致pH值升高等問題，進而影響毒性試驗結果之精確度。Lin (2001)針 對不同試驗時間和不同初始植種密度進行敏感度和變異性的分析，發 現生物毒性試驗隨著時間增加，其敏感度提高而C.V.值減少；而隨著 初始植種密度減少，其敏感度提高但C.V.值亦提高。而根據Vasseur and Pandard (1988)改變初始生物量進行批次試毒性試驗，結果也證實當 提高實驗初始生物量時，EC50值也顯著提升。在兼顧兩者的考量下，
選定最佳化條件為藻類初始植種密度1.5×104 cells/ml。
試驗時間的長短會關係到毒性試驗的敏感性和數據結果。過長的 試驗時間，會使得存在於BOD bottle 內的營養鹽不足，使得藻類有死 亡的現象，此外過長的試驗期間，也會使得毒性的反應消失。本實驗 選定的時間為四十八小時。
(5) 試驗基質
實驗培養基的成份是影響微生物毒性試驗結果的重要因子之一 (Chen, 1994)，其主要之影響培養基其主要之影響培養基因子有 pH、
硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽離子元素，於試驗中會額外加 入一定量之螫合劑(EDAT)。此外，氮、磷元素對於藻類生長與毒性
試驗結果影響最大。因此即針對上述之培養基質進行分別探討。
(1) 氮、磷的影響
在一般的自然水體中，存在這各種不同的生長元素，其中以 氮、磷兩種元素為藻類生長的主要限制因子。Lin et al. (2005)針對鋅 及酚進行毒性試驗結果後發現，當U.S. EPA營養基質的HCO3- 加倍 時，對毒性試驗敏感度之影響並沒有一定之趨勢，且並不會對其毒 性反應造成太大之影響。而影響藻類生長最主要的因素則為氮或磷 的濃度，因此該兩種元素即為藻類生長的限制性因子。
在水中只有PO43--P形態能夠直接被藻類吸收，因此在各種藻類 試 驗 方 法 中 ， 磷 皆 是 以 正 磷 酸 鹽 之 型 態 存 在( 如 ISO 和 OECD 是 KH2PO4，U.S.EPA 是 K2HPO4) ， 至 於 氮 的 形 態 ， 由 於 NO3--N 及 NH4+-N皆能被藻類吸收，在ISO和OECD用的是NH4+(NH4Cl)形態，
U.S.EPA用的則為NO3-(NaNO3)形態。Millington et al. (1988)發現自營 菌 無 法 像 異 營 菌 能 快 速 利 用NH4+-N而 快 速 生 長 ， 且 NO3--N不 似 NH4+-N那麼容易為異營菌所使用，因此一般自然環境中藻類的氮源 大都為硝酸態。
(2) 螫合劑(EDAT)的影響
一般為使試驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微 量元素，在未受污染的水體中螯合物的(EDTA)的濃度不超過 30
µg/L。 Berger et al. (1994)，於試驗時會在培養基中加入固定量之螯 合劑，如ISO於培養基中加入 78 µg/L的EDTA螯合劑可助於藻類與水 中必要元素的螯合，如此可確保毒性試驗期間藻類維持於對數生長 期。但是，從文獻上顯示若毒性試驗過程中添加螯合劑會與常見二 價金屬(Cu2+ 、Cd2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+等)形成親水性錯合物，其對 微生物的毒性比游離態之金屬來的低，進而影響毒性試驗結果，因 此本研究於試驗時亦不加EDTA (Mazidji et al., 1992)。
本實驗參照 1996 年 U.S.EPA 之建議，批次式培養藻類時加入固 定量(100%)之螫合劑於培養基中，於連續式培養藻類之營養基質中 亦加入固定量之(10%)之螫合劑，而於進行毒性試驗時培養基中則不 添加任何螫合劑。