平均中斷值（Cut-Off value）

為了了解毒物在低濃度下分析方式結果（模式迴歸分析及統計分 析）的差異及找出較適的水體保護指標，本研究中分別比較兩種指標 NOEC及EC10值，並利用平均中斷值( cut-off value )作為選擇NOEC或 EC10的客觀參考點。平均中斷值值本身與一組試驗的組內變異之平方 根成正比，因此組內變異較小的精確試驗有較小的平均中斷值，此中 斷值亦指出NOEC所能達到之保護程度的極限，使NOEC之定位更加 明顯，其計算公式如下：

平均中斷值( % reduction )= × 1 + 1 ×100 ni Sw nc

Xc T

nc

ni

T：查表所得（以 one-tail Dunnett’s test 在顯著程度為 5％之表格）

Xc

為控制組之平均值，

Sw

：組內變異之平方根 , ：控制組與處理組重複試驗次數。

第四章 實驗設備與方法

定水質之電阻值≧18.2 Mega-ohm（M Ω-cm）才可開始使用。

★ 培養裝置與迴轉式振盪儀： 培養裝置為自行裝配之培養箱，台

量幫浦，作為輸送營養基質到連續式培養母槽之動力，並可控制 其流量。

★ 幫浦管：幫浦管使用Materflex 公司，型號 H-96400-14。輸送管為 矽膠材質，不具毒性，可避免影響母槽之培養及毒性試驗之結 果。

★ 曝氣幫浦：使用之曝氣幫浦為一般常用之曝氣幫浦。

★ 浮子流量計：其功用在量測曝氣氣體之流量，本實驗母槽之曝器 量控制在400ml/min。需定時以泡沫流量計校正流量。

★ 空氣洗滌器：洗滌器的功用在去除曝氣氣體中的雜質，並可以藉 此濕潤氣體，增加氣體之溶解。

★ 庫德式電子顆粒計數器二代：功用為計數藻類細胞數。使用

Coulter Electronincs 公司之 Coulter Counter，型號為 MULTISIZER II，並以 5.06µm 標準顆粒乳液來校正。配有 50 及 100µm 孔徑之 玻璃管。本實驗使用100µm 孔徑之玻璃管，量測之顆粒直徑範圍 為2µm~60µm

★ BOD 瓶：為毒性試驗時使用之玻璃器皿。使用體積 300ml，直徑 8cm 之 BOD 玻璃瓶。上頭開口處有玻璃瓶塞，使其可以利用水封 之形式，避免外界氣體、物質等進入，而減少干擾。整個系統為 一個封閉式系

★ 光度測定計：使用TOPCON 產牌，型號 IM-2D，單位為 lux。

★ 溶氧測定儀： 美國 YSI 公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI 5100，附有 Model 5010 溶氧測定探頭 (BOD Probe) ，其探頭 部分裝有電動攪拌器，可以對樣品進行攪拌。溶氧量測定範圍為 0.0~60.0mg/L，精準度為±0.1%。

★ 酸鹼度（pH）測定儀：使用 Suntex 公司，Model SP-2200 之 pH

★ 濾膜：使用之濾膜分成兩種，過濾營養基質時使用Gelman

★ Science 九型號 66191 之 0.45µm 濾膜，過濾 Isoton II 時使用 60301 之0.2µm 濾膜。

★ 有機物濃度分析儀器：TOC 分析儀及 COD 比色法分析儀 試驗步驟：

本研究主要是利用BOD 瓶進行 16 種一級炔丙基醇類的藻類毒性 試驗，試驗共進行2 重複以上，每一次實驗為三重複，每一重複為 7 組不同濃度及 1 組控制組，濃度的換算係在實驗前先將配置好的 stock solution 以 TOC 定量，再依濃度比例將名義濃度(nominal concentration)換算為實際濃度，附表一所列出之實驗濃度為換算所 得到的進行實驗的實際濃度;實驗結果也分別以溶氧(△DO)、最終生 物數量(Final Yield)和細胞生長率(Growth Rate)為試驗終點進行單一 毒物之毒性試驗。

4.2 實驗前準備

4.2.1 培養基質的配製

本研究所使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組 成，配製方法如下。

將下列 1 ~ 7 的貯備液 (Stock Solution)各加 1 ml 至含 900 ml 去離子水中，再稀釋至 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營養基質之 pH 值調至 7.50 ±0.10，用錫箔紙包覆後置於 4℃冰箱中保存。

1. 硝酸鈉貯備液：溶解 12.750 g NaNO₃ 於 500 ml 去離子水。

2. 氯化鎂貯備液：溶解 6.082 g MgC1₂．6H₂O 於 500 ml 去離子水。

3. 氯化鈣貯備液：溶解 2.205 g CaCl₂．2H₂O 於 500 ml 去離子水。

4. 微營養鹽貯備液：共配製 stock1 (100％ EDTA)、 stock2 (10％

EDTA)和 stock3 (0％ EDTA)三瓶不同編號的貯備溶液，100﹪是 使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培養藻類時使用10﹪，進 行實驗時則使用不含EDTA 之貯備液。每瓶的配法為先秤取下列 七種藥品加入500 ml 去離子水中，

92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12．6H2O 207.690 mg MnCl2．4H2O 3.630 mg Na2MoO4．2H2O

1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2．2H2O 79.880 mg FeC13．6H2O

加完後，再加入螫合劑（EDTA），而所需加的量如下：

Na₂EDTA．2H₂O

stock1： 150 mg Na2EDTA．2H2O stock2： 15 mg Na2EDTA．2H2O

stock3： 不加

5. 硫酸鎂貯備液：溶解 7.350 g MgSO4．7H2O於 500 ml去離子水中。

6. 磷酸氫二鉀貯備液：溶解 0.522 g K2HPO4於500 ml去離子水中。

7. 碳酸氫鈉貯備液：溶解 7.5 g NaHCO3 於 500 ml 去離子水中。

其所含巨量及微量營養素濃度列於 Table 4.1 及 Table 4.2。營養 基質的滅菌是以 0.45μm 的濾膜過濾，過濾滅菌後的營養基質須保 存在 4 ℃ 且置 於陰暗無光線照射處，以免產生光化學反應。

Table 4.1 The consist of macro-algal medium

化合物 濃度(mg/l) 元素 各元素實際濃度

(mg/l)

NaNO3 25.5 C 2.14

NaHCO3 15.0 Na 11.0

P 0.186 K2HPO4 1.04

K 0.649

MgSO4-7H2O 14.7 S 1.91

MgCl2 5.7 Mg 2.9

CaCl2-2H2O 4.41 Ca 1.20

Table 4. 2 The consist of micro-algal medium

4.2.4 藻類之培養步驟及裝置

實驗物種Pseudokirchneriella subcapitata 在進行實驗前必須經過 2-7 天預培養(pre-culture)使之平均細胞體積(mean cell volume)達到 39-46 μm³ ，而藻類細胞數量達到 1.9~2.0×10⁶ cells/mL，在此條件下 才取藻類進行實驗。在培養藻類最需注意的步驟為微營養鹽貯備液 的加入方法，一開始活化藻類加的是stock1 (100％ EDTA)，而在連 續式母槽中培養藻類時使用的是stock2 (10％ EDTA)，且第一瓶硝 酸鈉貯備液和第六瓶磷酸氫二鉀貯備液加入體積需為其它五瓶的一 半。此外液態營養基質中之藻類可在4℃下保存四個星期，於四個星 期之後做移植以繼續培養保存菌種。Fig 4.1 為培養步驟且本實驗條 件依據(Lin, J.H., 2001)所決定之適當的條件下進行，條件如下：

1. 溫度：藻類之培養及毒性試驗皆在 24 ± 1℃下進行。

2. 光度：藻類之培養及毒性試驗皆在光度為 64.5 ± 10% μEm^-2s^-1下 進行，所使用之光源為連續白冷光。

3. 氮、磷濃度：培養藻類時使用一半之濃度，毒性試驗時則不變。

4. HCO₃濃度：15 mg/L。

5. pH：初始 pH 為 7.5 ± 0.1。

6. EDTA 含量：100%是使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培養 藻類時使用10%，進行實驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。

7. 試驗時間：四十八小時。

8. 藻類初始植種密度：1.5 × 10⁴ cells / ml。

9. 振盪頻率：100 rpm。

Fig 4. 1 藻類培養步驟示意圖

4.2.5 ISOTON II 之配製

（Multisizer Accucomp V. 2.01）進行進一步的分析。電子顆粒計數器 主要條件設定如下 Table 4.3。本實驗採用 100µm 孔徑之毛細玻璃 管。

計數時，取 1ml 的藻液置入 50ml 之量瓶內，再加入 ISOTON II 至 50ml，然後倒入燒杯中，置入顆粒計數器內計數。以顯示之讀數

值扣除空白顆粒數之數值，即純 ISOTON II 之背景值，所取之值為 連續三次值相差在2%者之平均值。

Table 4.3 The conditions of Coulter Counter

項 目 數 值

滿刻度電流量 (Full scale) 10mA

極性 (Polarity) +

電流 (Currents , I) 100

粒度下限 (Diameter Lower Threshold , Tl) 2.177µm 粒度上限 (Diameter Lower Threshold , Tu) 6.975µm

脈衝衰減倍率 (Attenuation , A) 1

脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1

警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF 孔徑（Orifice Diameter） 100

孔長（Orifice Length） 75

分析量 500µL

Setup Manual

Kd 924

Size 5.00 E

Size unit µm

4.3 儀器操作原理、步驟與設定條件

試驗需先進行有機物定量，其中試驗毒物中以TOC (總有機碳分 析儀) 及 COD-比色法定量定量，以下分別就儀器的原理及實驗步驟 分別描述。

4.3.1 TOC (總有機碳分析法)

總有機碳(TOC)定義為 Total Organic Carbon，而 TIC 為 Total Inorganic Carbon ， TC 則 為 Tatal Carbon ； 而 其 簡 單 的 原 理 為 TOC=TC-TIC；所使用的機型為 analytikjena 的 multi N/C 3100 TOC Analyzer(如 Fig 4.2)；所利用的分析方式有兩種：第一種為直接分析 模式(NPOC Method):NPOC=TOC，此方法的優點為分析時間快速，

適合高濃度的樣品分析，但缺點為樣品需為不具揮發性，由於如此較 不 適 用 於 本 研 究 ； 而 本 研 究 所 使 用 的 為 相 減 法(Differential Method):TOC=TC-IC，此方法可針對於具揮發性之有機化合物的偵 測，為確保於燃燒管中完全氧化，故將溫度設定於800-1000℃，在建 立背景校正曲線及分析樣品時採用注入不同濃度及相同體積樣品進 行，從分析結果也發現其誤差範圍較小(0.2%~5.4%)。

Fig 4.2 TOC 分析儀外觀圖

主體基本介紹:

1 . T I C 反 應 器 ， 2 . 冷 凝 器 ， 3 . 鹵 素 吸 附 U 型 管 ， 4 . 過 濾 器 ， 5 . 幫 浦 （ 磷 酸 ） ， 6 . L E D 指 示 燈 ， 7 . 液 體 注 射 針 ， 8 . 幫 浦 ， 9 . 磷 酸 瓶 1 0 . 托 盤

Fig 4.3 TOC 主體結構介紹

4.3.1.1 總有機碳分析之標準液配製流程

A. 總碳(TC)標準儲存液以 1000mg/L 為例：

秤 取 2.1254g KHP 鄰 苯 二 甲 酸 氫 鉀 (Potassium Hydrogenphthalate)→以超純水(＞18Ω)溶解並訂量至 1000ml

B. 總無機碳(TIC)標準儲存液以 1000mg/L 為例：

秤取4.41625g 碳酸鈉(Sodium Carbonate , Na2CO3)以及 3.5g 碳酸 氫鈉(Sodium Hydrogen Carbonate , NaHCO3)混合後→以超純水(＞

18Ω)溶解並訂量至 1000ml

C. TC/TIC 混合儲存液，分別取上述已配製好的 TC 及 TIC 標準儲液 各500ml 混合即可。

本實驗進行前，為了確保所配製的化合物 Stock solution 濃度的 準確性，會先建立一條校正曲線，濃度分別為100mg/L，200 mg/L，

400 mg/L ，600 mg/L，800，1000 mg/L；在進行毒性試驗前後分別 測定其濃度，而為了避免高濃度的stock solution 造成儀器測定的準確 性，會採用稀釋的方式再進行樣品的分析，此方法也從分析結果中看 到相當準確的結果。

4.3.1.2 Multi N/C 3100 總有機碳分析儀 標準操作程序(SOP)

3. 選擇軟體上方 Instrument，進入 Device control。

4. 點選 Regeneration TIC reactor，並按下 Start 清洗 TIC 反應槽(約 2~3 次)。

5. 選擇所要分析的方法。

6. 進入分析畫面，按下 Start 進行樣品分析，依照軟體說明放入樣

品。

7. 樣品分析完畢，按下軟體上方印表機圖示，列印分析報告。

肆、注意事項

1. 在使用前務必確認氣體壓力正常方可操作。

2. 若在電腦連線操作模式下，電腦未關機切勿關閉主機電源。

3. 主機電源開啟後，主機散熱出風口須保持良好通風。

4.3.2 COD-比色法

本實驗採用 COD-比色法定量濃度，其中藥品及配法參考環保署

「水中化學需氧量檢測方法-密閉迴流滴定法」方法，但 COD 濃度決 定則採直接比色方式而不採迴流滴定方式。COD 的檢量線是利用 KHP（鄰苯二甲酸氫鉀）濃度對吸光度（600nm）做圖。在此假設苯 甲醛類在 150 ℃酸性條件下可被強氧化劑重鉻酸鉀完全氧化成水和 二氧化碳，經由比色法求得稀釋後樣品 COD 濃度，再換算儲備液中 毒物的濃度。 詳細的操作步驟列於 Fig 4.4。

Fig 4.4 Setting and operate step of COD-colorimetry

4.3.2.1 COD-比色法藥品配製

配製前需準備500 mL 的玻璃瓶以 18.2 M Ω-cm 的試劑水沖洗乾 淨和乾燥。然後包覆鋁箔紙備用。本法所需藥品備製方法如下:（參 考環保署「水中化學需氧量檢測方法-密閉迴流滴定法」方法）

1. 重鉻酸鉀消化溶液：將 4.913 g 的重鉻酸鉀（先在 103℃ 烘乾 2 小時），加入約 500 mL 試劑水中，依序加入 167 mL 濃硫酸、

33.3 g 硫酸汞，混合溶解，冷卻至室溫後定量至 1 L。

2. 硫酸試劑：於 2.5 L 濃硫酸中加入 25 g 硫酸銀，放置 1 至 2 天（或以磁攪拌器攪拌數小時）使硫酸銀完全溶解。

3. COD 標準溶液：稱取 0.425 g 已在 120℃烘乾至恆重之苯二甲 酸氫鉀（KHP），溶解於試劑水中，定量至 1 L。KHP 的理論 COD 值為 1.176 mg / mg，本溶液的理論 COD 值為 500 mg / L。

4.4 密閉式藻類毒性試驗方法及步驟

4.4.1 實驗方法

在進行藻類毒性實驗前，先查尋過去是否有學者亦是以藻類進 行毒性試驗，並參考其實驗結果，接著以文獻中所記載之濃度，於 實驗前進行配製。若查無以藻類進行毒性試驗的資料時，則以文獻 中的實驗數據與本實驗室過去實驗數據之間的關連性，進行實驗毒

在進行藻類毒性實驗前，先查尋過去是否有學者亦是以藻類進 行毒性試驗，並參考其實驗結果，接著以文獻中所記載之濃度，於 實驗前進行配製。若查無以藻類進行毒性試驗的資料時，則以文獻 中的實驗數據與本實驗室過去實驗數據之間的關連性，進行實驗毒

在文檔中 以密閉式藻類毒性試驗方法評估一級炔丙基醇類之毒性 (頁 72-0)